Für eine normale Genomfunktion sind topologisch assoziierende Domänengrenzen erforderlich

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 435 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Grenzen der topologisch assoziierenden Domäne (TAD) unterteilen das Genom in verschiedene regulatorische Gebiete. Anekdotische Hinweise deuten darauf hin, dass ihre Störung die normale Genexpression beeinträchtigen und Krankheitsphänotypen verursachen kann1,2,3, aber das Gesamtausmaß, in dem dies geschieht, ist unbekannt. Hier zeigen wir, dass gezielte Löschungen von TAD-Grenzen eine Reihe von Störungen der normalen Genomfunktion und der Entwicklung des Organismus in vivo verursachen. Wir verwendeten CRISPR-Genombearbeitung bei Mäusen, um acht TAD-Grenzen (11–80 kb groß) einzeln aus dem Genom zu löschen. Alle untersuchten Deletionen führten zu nachweisbaren molekularen oder organisatorischen Phänotypen, zu denen veränderte Chromatin-Wechselwirkungen oder Genexpression, verringerte Lebensfähigkeit und anatomische Phänotypen gehörten. Wir beobachteten Veränderungen in der lokalen 3D-Chromatinarchitektur in 7 von 8 (88 %) Fällen, einschließlich der Verschmelzung von TADs und veränderten Kontaktfrequenzen innerhalb von TADs neben der gelöschten Grenze. Bei 5 von 8 (63 %) untersuchten Loci waren Grenzdeletionen mit einer erhöhten embryonalen Letalität oder anderen Entwicklungsphänotypen verbunden. Beispielsweise verursachte eine Deletion der TAD-Grenze in der Nähe von Smad3/Smad6 eine vollständige embryonale Letalität, während eine Deletion in der Nähe von Tbx5/Lhx5 zu einer schweren Lungenfehlbildung führte. Unsere Ergebnisse zeigen die Bedeutung von TAD-Grenzsequenzen für die Funktion des Genoms in vivo und bekräftigen die dringende Notwendigkeit, die potenzielle Pathogenität nichtkodierender Deletionen, die sich auf TAD-Grenzen auswirken, im klinischen Genetik-Screening sorgfältig zu berücksichtigen.

Eukaryotengenome falten sich in topologisch assoziierende Domänen (TADs), Chromatinsegmente im Sub-Megabasen-Maßstab, die durch eine hohe Chromatinkontaktfrequenz innerhalb der Domäne gekennzeichnet sind4,5,6. TADs stellen ein Schlüsselmerkmal der hierarchischen Genomorganisation dar, indem sie Chromatin-Nachbarschaften definieren, innerhalb derer regulatorische Sequenzen interagieren können, und gleichzeitig regulatorische Interaktionen über Grenzen hinweg isolieren5,7,8,9,10. TAD-Grenzen werden hauptsächlich durch Chromatin-Konformationstests definiert und gemessen und sind typischerweise mit einem Signatursatz von Proteinen verbunden, einschließlich CCCTC-Bindungsfaktor (CTCF), Komponenten des Strukturerhaltungskomplexes der Chromosomen (SMC) wie Kohäsin und Kondensin. und RNA-Polymerase II5,11,12,13,14. TADs entstehen durch Schleifenextrusion, wobei DNA-Stränge aus dem Kohäsin- oder SMC-Komplex herausgleiten, bis gebundene CTCF-Moleküle in einer konvergenten Ausrichtung gefunden werden13,15,16,17,18,19. Der Verlust von CTCF, Kohäsin oder des Kohäsin-Beladungsfaktors Nipbl führt zu einer TAD-Störung, während der Verlust des Kohäsin-Freisetzungsfaktors Wapl zu einer Verstärkung der TAD-Grenzen führt20,21. Interessanterweise bleiben etwa 20 % der TAD-Grenzen bei Verlust von CTCF22 stabil. Sowohl CTCF-vermittelte Mechanismen als auch die Transkription können die Bildung und Funktion von TADs beeinflussen, scheinen jedoch weder einzeln ausreichend noch allgemein erforderlich zu sein7,11,23,24. Somit können sich Chromatinzustand, Transkriptionsaktivität und TAD-Organisation gegenseitig beeinflussen, und die beobachtete Kernstruktur von Säugetiergenomen resultiert wahrscheinlich aus ihrem komplexen Zusammenspiel7,11,23,24,25.

Die genomischen Positionen der TAD-Grenzen sind bei allen Säugetierarten gut konserviert, was darauf hindeutet, dass ihre Funktion und Positionen innerhalb des Genoms evolutionären Einschränkungen unterliegen5,26,27,28. Diese Annahme wird durch den in der allgemeinen menschlichen Bevölkerung beobachteten allgemeinen Rückgang der Strukturvarianten an den TAD-Grenzen weiter gestützt26, während Störungen und Neuordnungen der TAD-Struktur mit der Fehlexpression von Genen in Verbindung gebracht werden und mit Entwicklungs- und Krebsphänotypen in Verbindung gebracht werden1,2, 3,29,30. Bei den meisten dieser Störungen handelte es sich jedoch um spontan auftretende große strukturelle Mutationen, die auch benachbarte genomische Merkmale wie regulatorische Elemente und/oder proteinkodierende Gene umfassten. Daher ist die spezifische Rolle der TAD-Grenzen bei diesen Phänotypen nicht genau verstanden. In der vorliegenden Studie untersuchen wir die funktionelle Notwendigkeit von TAD-Grenzsequenzen in vivo. Wir wählten acht unabhängige TAD-Grenzen in der Nähe von Genen aus, die während der Embryonalentwicklung aktiv waren, löschten diese Grenzen einzeln aus dem Mausgenom und untersuchten systematisch die Konsequenzen für Überleben, Genomorganisation, Genexpression und Entwicklung. Alle acht TAD-Grenzlöschungen führten zu Änderungen einer oder mehrerer dieser Eigenschaften. Wir beobachteten auch, dass der Verlust von Grenzen mit mehr CTCF-Stellen im Allgemeinen zu schwerwiegenderen Phänotypen führte und dass die schwerwiegendsten Phänotypen des Organismus mit deutlichen Veränderungen der Chromatinkonformation einhergingen. Zusammengenommen deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass TAD-Grenzsequenzen für eine normale Genomfunktion und -entwicklung erforderlich sind.

Um die In-vivo-Funktionen von TAD-Grenzsequenzen zu bewerten, konzentrierten wir uns auf Grenzen, die TADs flankieren und Gene mit bekannter Expression und Funktion während der Embryonalentwicklung beherbergen, um die Erkennung von Phänotypen zu erleichtern, die aus der Grenzlöschung resultieren. Aus einem genomweiten Satz von > 3300 zuvor annotierten TAD-Grenzen5,10 haben wir jede Grenze anhand der folgenden Kriterien bewertet und priorisiert: (1) CTCF-Belegung, aggregiert aus 62 veröffentlichten CTCF-ChIP-seq-Datensätzen, die als Proxy für dienten erwartete Gesamtfestigkeit der Isolierung (in den Zusatzdaten 1 aufgeführte Datensätze); (2) gleichzeitige Belegung von Untereinheiten des Kohäsinkomplexes und des Transkriptionsfaktors Znf14331 aus 38 veröffentlichten ChIP-seq-Datensätzen (Supplementary Data 1); (3) CTCF-Bindungskonservierung in orthologen Regionen in vier verschiedenen Säugetierarten 32 (Ergänzungsdaten 2); und (4) ob beide flankierenden TADs Gene mit bekannten Rollen in der Embryonalentwicklung enthalten, die vorzugsweise unterschiedliche Muster der gewebespezifischen Expression zeigen (Abb. 1, ergänzende Abbildung 1, ergänzende Daten 1–3, „Methoden“). TAD-Grenzen, die proteinkodierende Gene umfassten, wurden ausgeschlossen. Nach einer genomweiten Priorisierung haben wir 8 einzelne TAD-Grenzen aus dem Mausgenom durch pronukleäre Injektion befruchteter Eier mithilfe von CRISPR/Cas9 ausgewählt und gelöscht. Für alle Deletionen wurden die Außengrenzen der Grenzen durch kanonische Kriterien definiert, einschließlich des Vorhandenseins von CTCFs und Kohäsinkomplexproteinen, die das Kennzeichen von TAD-Grenzen sind, die über Zelltypen in eng verwandten Arten hinweg konserviert sind (Ref. 13, 15, 16). ,17,18,19; Einzelheiten siehe „Methoden“). Diese Deletionen hatten eine Größe von 11 bis 80 kb und entfernten alle bekannten CTCF- und Kohäsin-Bindungsstellen in jeder TAD-Grenzregion, während alle benachbarten proteinkodierenden Gene intakt blieben (Abb. 1, ergänzende Abbildung 1, ergänzende Daten 3, „Methoden“) “). Für alle acht Grenzen wurden erfolgreich lebende Gründermäuse gewonnen, die heterozygot für die gezielte Deletion waren, und in stabile Linien gezüchtet, um molekulare und organisatorische Phänotypen zu bewerten.

Schematische Darstellung der Selektions- und CRISPR/Cas9-basierten Löschstrategie zur Entfernung von TAD-Grenzen in vivo sowie der Arten der Phänotypisierung, die an den resultierenden Knockout-Mäusen (KO) durchgeführt wurden. Spezifische, einzeln gelöschte Grenzen sowie ausgewählte, in der Entwicklung exprimierte Gene, die jede gelöschte Grenze flankieren, sind ebenfalls dargestellt. B-Grenzelement, TFs-Transkriptionsfaktoren.

Um die In-vivo-Konsequenzen von TAD-Grenzlöschungen zu untersuchen, haben wir alle Linien auf ihre Lebensfähigkeit bei homozygoten Nachkommen untersucht (Abb. 2a, Zusatzdaten 4). Zuerst kreuzten wir heterozygote Deletionsmäuse untereinander, um festzustellen, ob homozygote Nachkommen lebensfähig und mit der von Mendel erwarteten Rate (25 %) vorhanden waren. Für Linie B1, in der eine Grenze zwischen Smad3 und Smad6 gelöscht worden war, wurden unter 329 lebend geborenen Welpen keine Mäuse beobachtet, die homozygot für die Löschung waren. Die zeitgesteuerte Zucht ergab, dass homozygote Embryonen am Embryonaltag 8,5 (E8,5) im erwarteten Mendelschen Verhältnis vorhanden sind, jedoch nicht in späteren Entwicklungsstadien (p < 0,05, Chi-Quadrat-Test, für alle untersuchten Stadien E10,5 und später; Abb . 2b und ergänzende Daten 4). Während bei E10.5 keine lebensfähigen homozygoten Null-Embryonen beobachtet wurden, beobachteten wir in diesem Stadium teilweise resorbierte homozygote Deletion-Embryonen, was weiter bestätigt, dass die homozygote Deletion der Grenze B1 zu einem vollständig durchdringenden Verlust der Lebensfähigkeit zwischen E8.5 und E10.5 führt (Abb. 2c und „Methoden“). Homozygote Deletionen von vier zusätzlichen Grenzorten waren mit teilweise eindringender embryonaler oder perinataler Letalität verbunden (Abb. 2a). Im extremsten Fall (B2) beobachteten wir einen Verlust von ~65 % der erwarteten homozygoten Nachkommen beim Absetzen (p = 3,90E–10, Chi-Quadrat-Test; Abb. 2a, ergänzende Abb. 2). Bei drei weiteren Grenzdeletionen (B3, B4, B5) beobachteten wir beim Absetzen einen Rückgang der Homozygoten um 20–37 % (p <0,05, Chi-Quadrat-Test, in allen Fällen, Abb. 2a, ergänzende Abb. 2). In keiner der Linien gab es signifikante Geschlechtsunterschiede zwischen lebensfähigen homozygoten Nachkommen (Ergänzende Abbildung 3 und Ergänzende Daten 4). Insgesamt zeigen diese Daten, dass die Mehrheit (5 von 8, 63 %) der getesteten Grenzelemente für die normale Lebensfähigkeit des Organismus erforderlich sind.

eine Mendelsche Trennung von Nachkommen aus heterozygoten Kreuzungen beim Absetzen für alle TAD-Grenzlöschungslinien. P21 postnataler Tag 21, N Anzahl der analysierten Welpen, Hom homozygot, Het heterozygot, WT-Wildtyp. b Mendelsche Trennung von Nachkommen aus heterozygoten Kreuzungen in bestimmten Embryonalstadien für den Grenzdeletionsort B1 (*p < 0,05). E Embryonaltag, N Anzahl der analysierten Embryonen. c Hellfeldbilder von repräsentativen Wurfgeschwister-Wildtyp- und homozygoten mutierten Embryonen, aufgenommen bei E10,5. Maßstabsleiste, 1 mm.

Um die Auswirkungen von TAD-Grenzlöschungen auf die Chromatin-Interaktionslandschaft zu bewerten, führten wir eine Hochdurchsatz-Chromosomenkonformationserfassung (d. h. Hi-C) unter Verwendung von Gewebe von erwachsenen Mäusen mit homozygoten Löschungen der TAD-Grenzen B2-B8 oder heterozygoten Löschungen der Grenze B1 durch. da die homozygote B1-Deletion embryonal tödlich ist (Abb. 3, ergänzende Abb. 4 und „Methoden“). Für vier Loci beobachteten wir, dass homozygote Nullmäuse einen Isolationsverlust an den TAD-Grenzen und eine gleichzeitige Verschmelzung benachbarter TADs aufwiesen (Loci B1–B3 und B6; Abb. 3, ergänzende Abb. 4). Ein Isolationsverlust wurde auch bei einer vierten Löschung der TAD-Grenze (B8) beobachtet, dies war jedoch nicht mit größeren Änderungen der gesamten TAD-Konfiguration an diesem Ort verbunden (ergänzende Abbildung 4). Als zweites Maß für die gestörte Chromatinstruktur verglichen wir den Richtungsindex (DI) zwischen Knockout-Mäusen und Wildtyp-Kontrollen. DI beurteilt den Trend von Kontakten stromaufwärts (nach links oder negativ) oder stromabwärts (rechts oder positiv) entlang einer Region des Chromosoms5 und Eckregionen peripher zu TADs, wo abrupte Verschiebungen bei Kontakten stromaufwärts und stromabwärts beobachtet werden (d. h. Stellen mit statistisch signifikanten Kontaktverzerrungen). werden rechnerisch als Grenzen zwischen flankierenden TADs bezeichnet). Veränderungen des DI wurden in homozygoten Nullmutanten in 6 der 8 durch Hi-C bewerteten Linien beobachtet (p ≤ 0,01, Wilcoxon-Rangsummentest, für die Loci B1–4, B6 und B8; Abb. 3, ergänzende Abb. 4). Darüber hinaus beobachteten wir bei drei TAD-Grenzlöschungen (Loci B4, B7 und B8) eine Verringerung der Fernkontakte in einem der TADs neben der gelöschten Grenze (ergänzende Abbildung 4). Insgesamt beobachteten wir bei 88 % (7 von 8) der untersuchten Linien Veränderungen der Chromatinkonformation. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Entfernung einzelner TAD-Grenzsequenzen die Isolierung zwischen benachbarten TADs beeinflusst, was zu einer veränderten Interaktionsfrequenz zwischen Sequenzen in normalerweise isolierten Domänen führt.

Von Hi-C abgeleitete Interaktionskarten für die TAD-Grenzorte B1 (a), B2 (b) und B6 (c). Cartoon der gelöschten TAD-Grenze, mit ausgewählten Entwicklungsgenen innerhalb der TADs, die die gelöschte Grenze flankieren (B), gefolgt von drei Heatmaps mit Hi-C-Kontaktdaten. Wärmekarten (gelb-blauer Farbcode) zeigen Hi-C-Kontaktmatrizen, die als beobachtete/erwartete Kontakte mit einer Auflösung von 25 kb in repräsentativen Lebergewebeproben von Wildtyp- (WT) und Knockout-Mäusen (KO) dargestellt werden. Beachten Sie für den TAD-Grenzort B1, dass WT das Wildtyp-Allel im Cast-Hintergrund und KO das Deletions-Allel im FVB-Hintergrund eines Tieres darstellt, das heterozygot für die TAD-Grenzdeletion ist. Die dritte Heatmap (rot-blauer Farbcode) zeigt Nettoänderungen der Hi-C-Wechselwirkungsfrequenzen im KO relativ zum WT. Die Positionen der Gene innerhalb des entsprechenden Locus werden entlang der Heatmap angezeigt. Die gestrichelte orangefarbene vertikale Linie zeigt die Position der gelöschten Grenze an. Es werden Isolationsprofile für die WT- und KO-Proben entsprechend den Wärmekarten angezeigt. Das Isolationsprofil weist jedem genomischen Intervall50 eine Isolationsbewertung zu, wobei lokale Minima die am stärksten isolierte Region darstellen. Beachten Sie die Abweichung von den Minima im Isolationsprofil für den KO im Vergleich zum WT (orangefarbenes Kästchen), was auf einen Isolationsverlust im KO hinweist. Balkendiagramme zeigen den Direktionalitätsindex (DI)5 für dieselben Proben. Grenzen werden in Regionen bezeichnet, in denen abrupte und signifikante Verschiebungen der stromaufwärts und stromabwärts liegenden Kontakte beobachtet werden, wie im WT (Black Box) dargestellt. Beachten Sie entweder die Zunahme an Kontakten oder den Verlust der Abgrenzung zwischen Upstream- und Downstream-Kontakten am gelöschten Standort im KO (rotes Kästchen). Die angezeigten Genomkoordinaten sind in mm10 angegeben. Weitere Einzelheiten zum Mausstammhintergrund (sofern zutreffend), zu Replikaten und zusätzlichen TAD-Grenzlöschungen finden Sie in der ergänzenden Abbildung 4 und „Methoden“.

Als nächstes untersuchten wir, ob der Verlust der TAD-Grenzen und die daraus resultierenden Veränderungen in der Chromatinarchitektur mit zusätzlichen molekularen oder physiologischen Phänotypen verbunden sind. Um festzustellen, ob die Deletionen die Expression von Genen in der Nähe jeder TAD-Grenze veränderten, haben wir die Genexpression in E11.5-Embryonen mit homozygoten Grenzdeletionen und passenden Wildtyp-Kontrollen gemessen. Für jede Linie wurde eine RNA-Sequenz in zwei verschiedenen Geweben mit bekannter Expression der in den benachbarten TADs befindlichen Gene durchgeführt, und eine qPCR wurde durchgeführt, um ausgewählte Gene in einer größeren Gewebegruppe nach einer Teilmenge der TAD-Grenzlöschungslinien abzufragen (Ergänzung). Abb. 5–6 und ergänzende Daten 5–6). In allen sieben mit diesem Ansatz untersuchten Linien haben wir zwei Fälle identifiziert, in denen sich die Expression eines Gens oder mehrerer Gene in einem TAD, das die Grenze flankiert, änderte. Embryonen, die für B2 homozygot-null waren, zeigten im Vergleich zu WT-Kontrollen eine 44-prozentige Reduktion von Tbx5 in der Lunge (padj = 0,04, ergänzende Abbildungen 5–6, ergänzende Daten 5–6). Die Herunterregulierung von Tbx5 in für B2 homozygoten Embryonen wurde durch die Beurteilung der Tbx5-Expression durch In-situ-Hybridisierung im Stadium E11.5 weiter bestätigt (ergänzende Abbildung 7). Embryonen, die homozygot für B6 waren, zeigten eine Verringerung der Expression von drei Genen um etwa 40 % (Meox2, Sostdc1 und Prkar2b im Herzen; Meox2 im sich entwickelnden Gesicht; padj = 0,04, ergänzende Abbildung 5 und ergänzende Daten 5). Obwohl nur eine Untergruppe von Geweben zu einem einzelnen Entwicklungszeitpunkt entnommen wird, deuten diese Daten darauf hin, dass allein die Löschung von TAD-Grenzen zu deutlichen Veränderungen der gewebespezifischen Genexpression führen kann.

Da die meisten TAD-Grenzlöschungen nicht zu einer vollständig durchdringenden embryonalen Letalität führten, untersuchten wir postnatale Phänotypen in Linien mit lebensfähigen homozygoten Nachkommen (Abb. 4). Bei ersten Untersuchungen der groben Anatomie, Morphologie und Histologie trat der bemerkenswerteste beobachtete Phänotyp bei Mäusen auf, die homozygot für Deletionen der Grenze B2 zwischen Tbx5 und Lhx5 waren und eine deutlich verringerte Lebensfähigkeit zeigten (Abb. 2a). Überlebende Knockout-Mäuse zeigten eine stark unterentwickelte Lunge mit einem Rest der linken Lunge (Abb. 4b). Dieser Phänotyp ist teilweise penetrant (12 von 20 Mäusen oder 60 %), wobei bei männlichen homozygoten Mutanten (82 %) höhere Raten beobachtet werden als bei weiblichen (33 %). Diese Lungenanomalie steht im Einklang mit der Herunterregulierung des benachbarten Tbx5-Gens in der sich entwickelnden Lunge, da der Phänotyp bei lungenspezifischen Knockouts von Tbx533 beobachtet wurde. Eine genauere Untersuchung der B2-Grenze ergab, dass eine Unterregion der gelöschten Region eine lungenspezifische Enhancer-Signatur im epigenomischen ENCODE-Atlas regulatorischer Sequenzen 34, 35 aufweist (ergänzende Abbildung 8a). Wir haben diese 852-bp-Subregion in einem transgenen Maus-Reporter-Assay getestet und festgestellt, dass sie ausreicht, um die Reportergen-Expression in der sich entwickelnden Lunge über mehrere embryonale Stadien der Maus hinweg zu steuern. (Ergänzende Abbildung 8b und „Methoden“). Allerdings führte weder die gezielte Löschung der Enhancer-Sequenz isoliert noch die Löschung des Enhancers in Verbindung mit einer unmittelbar benachbarten CTCF-Bindungsstelle zu den Lungenphänotypen, die bei der Löschung der gesamten B2-Grenzregion beobachtet wurden (ergänzende Abbildung 9), was auf einen Verlust von hinweist Der im Grenzbereich eingebettete Lungenverstärker ist nicht die Hauptursache für den beobachteten Lungenphänotyp.

a Überblick über die umfassende phänotypische Bewertung, die durchgeführt wurde, um die Auswirkungen der TAD-Grenzlöschung in vivo zu charakterisieren. b Homozygote Mutanten (KO) für den TAD-Grenzlöschort B2 zeigen Reste der linken Lunge. Maßstabsleiste, 5 mm.

Eine Teilmenge der verbleibenden Linien (B3, B5, B6, B7) wurde für eine umfassende Phänotypisierung basierend auf Parametern ausgewählt, die vom International Mouse Phenotyping Consortium (IMPC)36,37,38 definiert wurden. Die Tests umfassten eine standardisierte Reihe allgemeiner anatomischer, histologischer und Autopsieuntersuchungen, darunter 230 sensorische, neurologische und Verhaltenstests, 20 Tests zur Messung der Herzfunktion, 35 Stoffwechselfunktionstests, 20 hämatologische/immunologische Parameter und 36 Muskel-Skelett-Tests, durchgeführt in 7–12 geschlechts- und altersgleiche Paare von Kontrollmäusen und homozygoten Knockout-Mäusen aus jeder Linie (> 6000 Datenpunkte über 350 Gesamtmessungen; Abb. 4a, ergänzende Abb. 10 und ergänzende Daten 7). Diese systematischen Phänotypisierungsbemühungen identifizierten 30 zusätzliche Parameter mit individuell signifikanten Abweichungen von den Wildtyp-Kontrollen (Supplementary Data 7). Aufgrund der begrenzten Stichprobengröße und der großen Anzahl der bewerteten Parameter sind diese anfänglichen Beobachtungen jedoch nach der Korrektur für das Testen mehrerer Hypothesen im Allgemeinen nicht signifikant. Dennoch liefern diese Daten in Verbindung mit den unabhängig beobachteten Lebensfähigkeits-, Chromatin- und Expressionsphänotypen dieser Linien Hinweise für eine weitere eingehende Charakterisierung.

Aufgrund ihrer bekannten molekularen Rolle bei der Definition regulatorischer Territorien entlang der Chromosomen und bei der Verhinderung von Enhancer-Promotor-Wechselwirkungen zwischen benachbarten Chromatindomänen wurde die Hypothese aufgestellt, dass TAD-Grenzen für die normale Genomfunktion von entscheidender Bedeutung sind. Diese Annahme wurde durch Beobachtungen von Krankheitsphänotypen gestützt, die mit strukturellen Mutationen verbunden sind, die TAD-Grenzen umfassen, allerdings in den meisten Fällen in Kombination mit angrenzenden genomischen Merkmalen wie regulatorischen Sequenzen oder proteinkodierenden Genen2,8,39,40. Um ihren allgemeinen Bedarf an einer normalen Genom- und Organismusfunktion zu beurteilen, führten wir gezielte genomische Deletionen von acht TAD-Grenzen bei Mäusen durch und verwendeten dabei die kanonischen Merkmale von TAD-Grenzen basierend auf molekularen Signaturen (Lage zwischen TADs; CTCF und Kohäsin-Bindungsstellen), um das Ende auszuwählen Punkte jeder Löschung. Wir konzentrierten uns auf Genomregionen, die Gene mit bekannten Entwicklungsrollen enthielten, um die Erkennung möglicher Phänotypen zu erleichtern. Bemerkenswerterweise führten alle acht TAD-Grenzlöschungen zu abnormalen molekularen oder organisatorischen Phänotypen (zusammengefasst in Abb. 5). Dazu gehörten sieben Linien, die Veränderungen der Chromatin-Interaktionen innerhalb oder zwischen benachbarten TADs zeigten, zwei Linien mit erheblichen Veränderungen des Expressionsniveaus benachbarter Gene, fünf Linien, die vollständige oder teilweise embryonale Letalität zeigten, und eine Linie, die Defekte in der Lungenentwicklung zeigte.

Die Spalten zeigen spezifische TAD-Grenzen (B1–8), die in dieser Studie gelöscht wurden, wichtige Entwicklungsgene innerhalb der flankierenden TADs (Genei-1 und Genei+1), ungefähre Grenzdeletionsgrößen (Deletioni) und die Anzahl der mutmaßlichen gelöschten CTCF-Cluster. Alle Daten in den nachfolgenden Spalten sind Zusammenfassungen der phänotypischen Informationen für Mäuse, die homozygot für die jeweiligen TAD-Grenzdeletionen sind. Dazu gehören Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit (vollständig letal durch rotes Kreuz markiert, subviabilität durch roten oder gelben Pfeil dargestellt, um das Ausmaß der Wirkung anzuzeigen, keine Abweichung von den erwarteten Mendelschen Verhältnissen durch grüne Häkchen dargestellt), Fruchtbarkeit sowohl männlicher als auch weiblicher homozygoter Tiere (mindestens). Drei homozygote Männchen und drei homozygote Weibchen wurden auf ihre Fortpflanzungsfähigkeit untersucht (grüne Häkchen zeigen fruchtbare Tiere an) und es wurden offensichtliche physiologische Phänotypen beobachtet. Die Spalte für Chromatinveränderungen zeigt das Vorhandensein signifikanter DI-Änderungen und/oder signifikanter Veränderungen der Chromatinkontaktfrequenzen innerhalb der Domäne in den flankierenden TADs an, bewertet durch Hi-C. Die letzte Spalte gibt an, ob signifikante Expressionsänderungen für Gene in der Nähe der gelöschten TAD-Grenze beobachtet wurden. na nicht anwendbar und nicht bestimmt.

Von den sieben TAD-Grenzlöschungen, die Veränderungen in den Chromatin-Wechselwirkungen zeigten, führten vier zu einer Verschmelzung der benachbarten TADs in den jeweiligen Knockout-Linien (B1–3, B6), was auf eine schwere Störung der Grenzfunktion hinweist. In den übrigen Fällen blieben die angrenzenden TADs insgesamt intakt, obwohl der durch kanonische TAD-Merkmale definierte TAD-Grenzbereich gelöscht wurde. Dies impliziert, dass aktuelle Ansätze zur Definition der Außengrenzen von Domänengrenzelementen möglicherweise unvollständig sind und dass zusätzliche lokale Determinanten eine aufschlussreiche Rolle bei der Bildung und Aufrechterhaltung der Chromatindomäne spielen könnten. Interessanterweise beobachteten wir eine verringerte Lebensfähigkeit in zwei Linien (B4, B5), wenn keine zusammengeführten TADs vorhanden waren, was auf funktionelle Auswirkungen von Grenzlöschungen hindeutet, die unabhängig von der Zusammenführung benachbarter Domänen sind. Dies steht im Einklang mit der Vorstellung, dass selbst geringfügige Änderungen in der dreidimensionalen Chromatinstruktur zu erheblichen Änderungen in der lokalen Genexpression führen können41. Unsere Ergebnisse deuten auf regulatorische oder andere funktionale Auswirkungen von Grenzlöschungen hin, die auftreten, wenn benachbarte Domänen nicht vollständig zusammengeführt werden. Beispielsweise führt der Verlust der Grenze B4 nicht zu einer Domänenverschmelzung, sondern führt zu einer verringerten Lebensfähigkeit des Organismus, was vermutlich auf subtile Veränderungen in der Chromatinstruktur und nachgeschalteten Regulierungsmechanismen zurückzuführen ist.

Begleitend zu den Veränderungen in der Chromatinkonformation beobachten wir Veränderungen in der Genexpression für bestimmte Gewebe zum untersuchten Zeitpunkt für zwei (B2 und B6) von sieben TAD-Grenzorten. Für die Deletion B6 liegen Gene mit veränderter Expression (Meox2, Sostdc1, Prkar2b) in Regionen ohne signifikante Veränderungen im dreidimensionalen Kontext im Vergleich zur Wildtyp-Konfiguration. Eine mögliche Erklärung ist, dass subtilere Änderungen an Subtopologien, die in flankierenden TADs verschachtelt sind, bei der Auflösung unserer Konformationsdaten nicht erkannt wurden, aber ausreichen, um die Wechselwirkungen zwischen regulatorischen Elementen und Promotoren dosisempfindlicher Gene zu stören42,43.

Bei Mäusen mit einer homozygoten Deletion der Grenze B1 wurde eine vollständig durchdringende embryonale Letalität beobachtet. Während der genaue betroffene Entwicklungsprozess in dieser Studie nicht bewertet wurde, zeigt dieses Ergebnis eine entscheidende Rolle dieser Grenze für die Lebensfähigkeit und die normale Entwicklung. Die Grenz-B2-Deletion verursachte eine ausgeprägte Lungenfehlbildung, die einen Phänotyp wiedergibt, der mit der lungenspezifischen Deletion des nahegelegenen Tbx5-Gens verbunden ist33. Interessanterweise enthält diese Grenze einen Entwicklungs-Lungen-Enhancer in unmittelbarer Nähe einer wichtigen CTCF-Bindungsstelle, aber weder die Deletion des Enhancers noch die Deletion der CTCF-Stelle noch die Deletion dieser beiden kleinen Unterregionen in Kombination rekapituliert den Phänotyp, der bei der Deletion beobachtet wurde komplette B2-Grenzregion. Diese Beobachtung verstärkt die Möglichkeit, dass kritische molekulare Funktionen über die Länge des erweiterten TAD-Grenzbereichs eingebettet sind, was das Vorhandensein zusätzlicher, funktionell redundanter Lungenverstärkerelemente44 einschließen kann, die von der B2-Deletion betroffen sind. Unsere Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit eines besseren Verständnisses der räumlichen Abgrenzungen von Grenzregionen innerhalb des Genoms. Für TAD-Grenzorte, an denen wir Abweichungen von der normalen Lebensfähigkeit beobachten, aber keine anderen offensichtlichen physiologischen Phänotypen (B3–5) identifizieren, müssen die molekularen Mechanismen, die den Überlebensphänotypen zugrunde liegen, noch ermittelt werden. Obwohl wir eine einigermaßen umfassende Untersuchung durchgeführt haben, um mögliche Genexpression und Phänotypen von Organismen zu bewerten, können wir das Vorhandensein zusätzlicher Genexpression oder anderer phänotypischer Veränderungen, die sich zum Zeitpunkt der Entwicklung oder in anderen als den untersuchten Gewebe- oder Umweltbedingungen manifestieren, nicht ausschließen. Wir können auch das Vorhandensein sehr subtiler Phänotypen nicht ausschließen, beispielsweise Veränderungen im zeitlichen Ablauf der Entwicklung.

Die in dieser Studie durchgeführten Grenzdeletionen führten zu einem Spektrum von Phänotypen, die von schwer (vollständige embryonale Letalität) bis mild (nur molekulare Phänotypen) reichten. Ebenso variierten die gewählten Grenzen hinsichtlich der Anzahl der vorhandenen CTCF-Cluster stark, von zwei in den Grenzen, die nur veränderte Chromatin-Wechselwirkungen oder Genexpressionsänderungen verursachten, über drei bis fünf in den Grenzen, die eine verringerte Lebensfähigkeit verursachten, bis hin zu 11 CTCF-Clustern in der Grenze verursachte den schwerwiegendsten Phänotyp. Es ist bekannt, dass die Dosierung von CTCF an TAD-Grenzen die Bildung von TADs beeinflusst22,45,46, und obwohl die Anzahl der hier untersuchten Grenzen zu gering ist, um eine statistisch belastbare Korrelation herzustellen, ist es verlockend zu spekulieren, dass es zu Löschungen von Grenzen mit mehr CTCF kommt Standorte neigen dazu, ausgeprägtere Phänotypen zu verursachen.

Unsere Ergebnisse haben wichtige Auswirkungen auf die Interpretation von Daten zur Sequenzierung des gesamten menschlichen Genoms in klinisch-genetischen Umgebungen. Positionseffekte, die sich aus großen strukturellen Variationen ergeben, sind in der Humangenetik gut bekannt47, aber es ist oft schwierig, solche Deletionen und/oder Neuanordnungen funktioneller Sequenzen, wie proteinkodierender Gene und Enhancer, von Effekten zu trennen, die auf die Entfernung von Grenzsequenzen zurückzuführen sind. Bemerkenswerterweise ist keine der acht Regionen, die in dieser Studie aus dem Mausgenom gelöscht wurden, in etwa 760.000 verfügbaren menschlichen Genomen vollständig gelöscht, was mit ihrer funktionellen Bedeutung übereinstimmt (gnomAD-SV v2.148 und rCNV249). Ein entscheidendes zukünftiges Ziel wird darin bestehen, die Beziehung zwischen menschlichen Mutationen innerhalb der Tausenden von genomweiten TAD-Grenzen und deren Auswirkungen auf die Variation und Krankheit des menschlichen Phänotyps zu bestimmen. Die vorliegende Studie weist darauf hin, dass die Entfernung der relativ kleinen TAD-Grenzsequenzen selbst molekulare oder organisatorische Phänotypen verursacht und daher Strukturvarianten, die TAD-Grenzdeletionen bei menschlichen Patienten umfassen, als mögliche Ursachen für Pathogenität in Betracht gezogen werden sollten.

Zuvor veröffentlichte Chromosomenkonformationserfassungsdaten wurden in dieser Studie für kombinierte Analysen und Auswahl von TAD-Grenzlöschorten verwendet, wobei TAD-Grenzaufrufe auf der maximalen Anreicherung von CTCF an den TAD-Grenzen und ihrer Konsistenz über Zelltypen hinweg basierten10. Über 3300 genomweit annotierte TAD-Grenzen 5, 10 wurden dann anhand einer gewichteten Bewertung bewertet (siehe ergänzende Abbildung 1), die die Stärke der Isolierung basierend auf der Belegung des CCCTC-Bindungsfaktors (CTCF), der gleichzeitigen Belegung von Untereinheiten des Kohäsinkomplexes usw. umfasst der Transkriptionsfaktor Znf14331 und die CTCF-Bindungskonservierung in orthologen Regionen in vier verschiedenen Säugetierarten (Abb. 1, ergänzende Abb. 1). Zu diesem Zweck haben wir etwa 100 einzelne ChIP-seq-Datensätze analysiert (aufgelistet in den Zusatzdaten 1). CTCF-gebundene Stellen im gesamten Genom wurden räumlich geclustert und anhand der oben hervorgehobenen Kriterien innerhalb von Regionen 40 kb stromaufwärts und stromabwärts jeder TAD-Grenze individuell bewertet. Auf der Grundlage der dazwischenliegenden gebundenen CTCFs wurde eine Gesamtbewertung für jede Grenze erstellt, wobei Grenzen, die proteinkodierende Gene überlappen, ausgeschlossen wurden, wodurch eine eindeutige Interpretation der funktionellen Notwendigkeit von TAD-Grenzen in der Säugetierentwicklung ermöglicht wurde. Darüber hinaus wurden Grenzen, an denen flankierende TADs Gene beherbergten, die für die Entwicklung wichtige Transkriptionsfaktoren kodierten und vorzugsweise (soweit möglich) ein divergentes Muster der gewebespezifischen Expression zeigten, für die In-vivo-Deletion priorisiert. Unsere Auswahlkriterien berücksichtigten nicht die Direktionalität von CTCF-Motiven bei der Auswahl von TAD-Grenzorten zur Löschung (ergänzende Abbildung 1).

Alle Tierversuche wurden vom Lawrence Berkeley National Laboratory Animal Welfare Committee überprüft und genehmigt. Die Mäuse wurden täglich auf Nahrungs- und Wasseraufnahme überwacht und die Tiere wurden wöchentlich vom Vorsitzenden des Tierschutz- und Forschungsausschusses und dem Leiter der Tierhaltung in Absprache mit dem Veterinärpersonal untersucht. Das LBNL ACF ist von der American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) akkreditiert. TAD-Grenz-Knockouts wurden bei Mäusen des Mus-musculus-FVB-Stamms durchgeführt, mit Ausnahme der TAD-Grenze B1, wo heterozygote Null-Mäuse in einem gemischten Stammhintergrund (Cast/Eij und FVB) speziell für die Durchführung der Hi-C-Assays generiert werden mussten. In dieser Studie wurden Mäuse aller Entwicklungsstadien vom Embryonaltag 10,5 bis P0 sowie Mäuse zwischen der 4. und 16. Woche verwendet. Für die Analyse wurden Tiere beiderlei Geschlechts verwendet. Strategien zur Auswahl der Stichprobengröße und zur Randomisierung sind in den einzelnen Methodenabschnitten enthalten. Sofern nicht anders angegeben, resultierten alle in der Arbeit beschriebenen phänotypisierten Mäuse aus der Kreuzung heterozygoter TAD-Grenzlöschmäuse, um den Vergleich übereinstimmender Wurfgeschwister verschiedener Genotypen zu ermöglichen. Die Proben wurden präpariert und gegebenenfalls blind hinsichtlich des Genotyps verarbeitet.

Transgene Mäuse wurden unter Verwendung des Mus-musculus-FVB-Stamms und eines Standard-CRISPR/Cas9-Mikroinjektionsprotokolls50 erzeugt. Kurz gesagt wurde Cas9-Protein (Integrated DNA Technologies Katalog-Nr. 1081058) in einer Endkonzentration von 20 ng/μl mit sgRNA, die auf den beabsichtigten Locus abzielt (50 ng/μl, für alle sgRNAs zusammen), in Mikroinjektionspuffer (10 mM Tris, pH 7,5; 0,1 mM EDTA). Die Mischung wurde in die Vorkerne von befruchteten FVB-Embryonen im Einzelzellstadium injiziert, die aus den Eileitern superovulierter 7–8 Wochen alter FVB-Weibchen gewonnen wurden, die mit FVB-Männchen gepaart waren (sgRNA-Sequenzen finden Sie in den ergänzenden Daten 8). Die injizierten Embryonen wurden dann etwa 2 Stunden lang in M16-Medium, ergänzt mit Aminosäuren, bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Die Embryonen wurden anschließend in die Gebärmutter pseudoschwangerer CD-1-Leihmütter übertragen. Gründermäuse (F0) wurden mittels PCR mit High Fidelity Platinum Taq Polymerase (Thermo Fisher) genotypisiert, um diejenigen mit den gewünschten NHEJ-generierten Deletionsbruchpunkten zu identifizieren. Sanger-Sequenzierung wurde verwendet, um Deletionsbruchpunkte in F0- und F1-Mäusen zu identifizieren und zu bestätigen (Ergänzende Abbildung 11, Ergänzende Daten 8 für CRISPR-sgRNA-Vorlagen und Ergänzende Daten 9 für Primersequenzen und PCR-Amplifikate). Für jeden der TAD-Grenzdeletionsorte wurden zwischen einem und vier F0-Gründern erhalten, die jeweils gleichzeitig durch PCR auf mögliche Inversionen untersucht wurden. Nur diejenigen F0-Gründer, die saubere Deletionsallele trugen, wurden mit Wildtyp-Mäusen rückgekreuzt und gezüchtet, um heterozygote F1-Mäuse zu erhalten. Angesichts der Tatsache, dass jede der Löschungen über alle Gründer hinweg in der NHEJ-vermittelten Löschungsspanne konsistent war, wurde letztendlich nur eine Gründerlinie für jeden Standort ausgewählt, um die Züchtung für die Experimente in diesem Artikel zu erweitern. Eine zusätzliche Bestätigung und Visualisierung der gelöschten TAD-Grenzen ist in Hi-C-Kontaktmatrizen ersichtlich, die aus Hi-C-Experimenten an Gewebe von homozygoten TAD-Grenzmutanten im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen resultieren (ergänzende Abbildung 11).

Die Erzeugung von Deletionsmäusen für ausgewählte regulatorische Sequenzen innerhalb der TAD-Grenze B2 umfasste einzelne Deletionen eines Lungenverstärkers (Enhancer Δ), einer benachbarten CTCF-Stelle (CTCF Δ) und die Deletion des Enhancers zusammen mit der CTCF-Stelle (Enhancer + CTCF Δ) als Kontrolle . Diese Mäuse wurden identisch mit den oben beschriebenen Methoden erzeugt und Einzelheiten werden entsprechend bereitgestellt (Ergänzende Abbildung 12, Ergänzende Daten 8 für CRISPR-sgRNA-Vorlagen und Ergänzende Daten 9 für Primersequenzen und PCR-Amplifikate).

Darüber hinaus wurden Mäuse, die heterozygot für die TAD-Grenze B1 waren, zur Durchführung von Hi-C-Assays für diese TAD-Grenz-Knockout-Linie verwendet. Um jedoch das Problem der bioinformatischen Unterscheidung der Allele zu umgehen, waren Mäuse in einem gemischten Hintergrund erforderlich, um die Veränderungen der Hi-C-Kontakte nach Grenzlöschung zu beurteilen. Zu diesem Zweck haben wir Wildtyp-Cast/Eij-Mäuse vom Jackson Laboratory erhalten und diese mit unseren vorhandenen FVB-Mäusen gekreuzt, die heterozygot für die TAD-Grenzlöschung B1 waren. Die aus diesen Kreuzungen resultierenden heterozygoten Mäuse führten zu heterozygoten TAD-Grenz-B1-Tieren, die einen Cast/Eij-Hintergrund für das Wildtyp-Allel und einen gleichzeitigen FVB-Hintergrund für das Deletions-Allel aufwiesen.

Die beschriebenen Mauslinien werden über das Mutant Mouse Resource and Research Center, www.mmrrc.org, zur Verfügung gestellt und können im MMRRC-Katalog unter Verwendung des Symbols der regulatorischen Region oder der Research Resource Identifiers (RRID) (Supplementary Data 10) gefunden werden.

Die Stichprobengrößen wurden empirisch auf der Grundlage unserer früheren Studien ausgewählt44,51. Die Mendelsche Segregation wurde zunächst postnatal an Tieren beurteilt, die aus heterozygoten Kreuzungen hervorgegangen waren, und ermöglichte so den Vergleich übereinstimmender Wurfgeschwister verschiedener Genotypen. Gegebenenfalls wurden die Mendelschen Verhältnisse zu embryologischen Zeitpunkten bewertet, wie es der Phänotyp von Fall zu Fall erforderte. Für die TAD-Grenze B1 haben wir bei E13.5 zwar selten homozygote Null-Mutanten erhalten, bei E10.5 wurden jedoch bei einer systematischen Bewertung der Mendelschen Segregation in 213 Embryonalproben, die zwischen dem Embryonaltag 8,5 und 15,5 geerntet wurden, keine lebensfähigen homozygoten Null-Embryonen beobachtet diese Knockout-Linie (Ergänzende Daten 4).

Hi-C-Experimente wurden an Ex-vivo-Lebergewebe männlicher Mäuse am 56. Tag nach der Geburt durchgeführt. Nach der Euthanasie wurden Leberproben entnommen, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und vor der 15-minütigen Vernetzung mit 1 % Formaldehyd pulverisiert. Aufgetautes vernetztes Gewebe wurde mit einem gentleMACS Tissue Dissociator unter Verwendung des werkseitig eingestellten Programms dissoziiert und durch ein 40 µm BD-Zellsieb filtriert. Zellpellets wurden 6 Minuten lang bei 4 ° C mit 1000 × g zentrifugiert und mit 3 ml 1 M Saccharose überschichtet. Die Suspension wurde 6 Minuten lang bei 4 ° C und 2500 × g zentrifugiert. Pelletierte Kerne wurden in 50 μl 0,5 % SDS resuspendiert und 10 Minuten bei 62 °C inkubiert. SDS wurde durch Zugabe von Triton X-100 und 15-minütiger Inkubation bei 37 °C gelöscht. Chromatin wurde mit MboI (100U; NEB) bei 37 °C über Nacht unter Schütteln (1000 U/min) verdaut. Das Enzym wurde durch 20-minütiges Erhitzen auf 62 °C inaktiviert. Fragmentierte Enden wurden mit Biotin-14-dATP (Life Technologies) unter Verwendung von Klenow-DNA-Polymerase (0,8 U μl-1; NEB) für 60 Minuten bei 37 °C unter Rotation (900 U/min) markiert. Anschließend wurden die Enden 4 Stunden lang bei Raumtemperatur unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (4000 Einheiten; NEB) ligiert. Die umgekehrte Vernetzung wurde mit Proteinase K (1 mg, NEB) und Inkubation bei 55 °C über Nacht durchgeführt. Die Verdauungseffizienz und Ligationseffizienz wurden durch Gelelektrophorese überprüft. Als nächstes wurde die DNA durch Ethanolfällung gereinigt und mit einem Covaris Focused-Ultraschallgerät (M220; Arbeitszyklus: 10 %; Leistung: 50, Zyklen/Burst: 200, Zeit: 70 s) geschert. Nach Größenauswahl und Reinigung mit SPRI-Perlen (Beckman Coulter) wurde die DNA mit Dynabeads MyOne Streptavidin T1-Perlen (Life Technologies) biotinzerlegt. Schließlich wurden Sequenzierungsbibliotheken auf T1-Magnetkügelchen vorbereitet und die abschließende PCR-Amplifikation wurde sieben Zyklen lang basierend auf der qPCR-Analyse durchgeführt. Mit Perlen gereinigte Bibliotheken wurden mit einem Qubit quantifiziert und dann zur Größenverteilungsbewertung mit High Sensitivity D1000 ScreenTape auf einer TapeStation (Agilent) verdünnt.

Hi-C wurde an jeweils zwei biologischen Replikaten sowohl für homozygote Null- als auch für Kontrollproben für jeden der TAD-Grenzdeletionsorte B2–8 durchgeführt. Für die TAD-Grenze B1 wurde Hi-C an zwei biologischen Replikaten durchgeführt, die für die Grenzdeletion heterozygot null waren, und einer Wildtyp-Probe, und alle diese Proben wurden für das Folgende aus Hintergrundmäusen mit gemischten Stämmen (Cast/FVB) generiert Gründe dafür sind (i) die frühe embryonale Letalität homozygoter Mutanten für diese Mauslinie, (ii) der Bedarf an großer Gewebemenge für die Durchführung von Hi-C-Experimenten, (iii) die Einschränkungen bei der Verwendung heterozygoter Mutanten im isogenen FVB-Hintergrund für Hi-C-Experimente , da diese allelspezifische Downstream-Analysen problematisch machen würden. Details zur Generierung dieser Mäuse werden unter „Methoden“ beschrieben.

Die Hi-C-Datenverarbeitungspipeline ist unter https://github.com/ren-lab/hic-pipeline verfügbar. Kurz gesagt, in Bezug auf die TAD-Grenzorte B2–8 wurden Hi-C-Reads mit BWA-MEM52 für jeden Read einzeln auf das Maus-mm10-Referenzgenom ausgerichtet und dann gepaart. Für den TAD-Grenzort B1, bei dem Gewebe von Tieren mit gemischtem Stammhintergrund verwendet wurde, konstruierten wir unter Verwendung der SNP-Informationen sowohl Cast- als auch FVB-Genomsequenzen und verwendeten dann BWA-MEM46, um die Rohdaten sowohl an der Cast- als auch an der FVB-Genomsequenz auszurichten. Als nächstes verglichen wir für jeden Lesevorgang die beiden Mapping-Qualitäten und die Mapping-Länge und wählten die Mapping-Ergebnisse mit höheren Bewertungen. Über diesen Analyseschritt hinaus folgten nachgelagerte Analysen für alle TAD-Grenzorte denselben Standards. Für chimäre Lesevorgänge wurden nur 5′-endkartierte Positionen beibehalten. Doppelte Lesepaare, die demselben Speicherort zugeordnet waren, wurden entfernt, sodass nur noch ein eindeutiges Lesepaar übrig blieb (MarkDuplicates im Picard-Paket). Die ausgegebenen BAM-Dateien wurden zur Visualisierung in Juicebox53,54 in das Juicer-Dateiformat umgewandelt. Kontaktmatrizen wurden als beobachtete/erwartete Kontakte mit einer Auflösung von 25 kb dargestellt und mit der Knight-Ruiz-Matrixausgleichsmethode normalisiert. Der Richtungsindex für jede Probe wurde außerdem mit einer Auflösung von 25 kb generiert5. Der Isolationswert für jede Probe wurde mit einer Auflösung von 25 kb und einem Quadrat von 500 kb generiert56. Für die Daten in Abb. 3 wurden vor der Berechnung der Differenz die Direktionalitätsindex-Werte (DI) von fünf Bins auf der rechten und fünf Bins auf der linken Seite gemittelt. Ein höherer DI-Delta-Score weist auf eine stärkere Grenze hin. Ein Wilcoxon-Rangsummentest wurde zwischen KO- und WT-Proben unter Verwendung von DI-Delta-Scores durchgeführt und ein p-Wert ≤ 0,05 wurde als signifikant angesehen. Als Negativkontrolle wurde derselbe statistische Test an ~2900 TAD-Grenzen durchgeführt, die sich nicht mit Deletionen überlappen, und Unterschiede zwischen WT- und KO-Proben wurden mit demselben statistischen Test unter Verwendung einer Signifikanzschwelle von p ≤ 0,05 bewertet.

Wir haben im gesamten Genom keine anderen Grenzen beobachtet, die einen signifikanten Unterschied im DI-Delta-Score zeigten, der über dem der gelöschten Grenzen B2, B3, B4, B6 und B8 lag, für die wir signifikante Veränderungen im DI-Delta-Score beobachtet hatten. Zwölf Grenzen (0,4 %) im gesamten Genom zeigten signifikante Veränderungen (p ≤ 0,05) und waren quantitativ gleich oder übertrafen diejenigen, die an den gelöschten TAD-Grenzen B5 und B7 beobachtet wurden, für die wir keine signifikanten Veränderungen im DI-Delta-Score beobachteten (S > 0,05; Abb. 3 und ergänzende Abb. 4. Interaktionshäufigkeiten zwischen genomischen Loci wurden zusätzlich auf Juicebox visualisiert (ergänzende Abb. 4)53,54.

Eine Reihe von Geweben, einschließlich Vorderhirn, Mittelhirn, Hinterhirn, Gesicht, Herz, obere und untere Gliedmaßen und Neuralrohr, wurde auf standardisierte Weise bei E11,5 aus homozygoten Mutanten sowie Wildtyp-Embryonen von Wurfgeschwistern für jede TAD-Grenzdeletion entnommen loci34. Die Proben wurden in 100 μl kommerziell erhältlichem (Qiagen) RLT-Puffer suspendiert. Gesamt-RNAs wurden mit dem Qiagen RNeasy Mini Kit (Katalog-Nr. 74104) isoliert. Für jeden der TAD-Boundary-Deletionsorte B2–B8 wurde außerdem ein Satz von zwei relevanten Gewebetypen ausgewählt und auf standardisierte Weise für RNA-seq-Bibliotheken verarbeitet. Sequenzierungsbibliotheken wurden von Novogene erstellt und auf einem Illumina NovaSeq6000 (150 bp, gepaartes Ende) sequenziert. RNA-seq-Daten wurden mithilfe der bei DNAnexus (https://www.dnanexus.com) implementierten ENCODE Uniform Processing Pipelines (https://www.encodeproject.org/pipelines/) analysiert. Mithilfe der ENCODE RNA-seq (Long) Pipeline – 1 (Single-End)-Replikationspipeline (Code verfügbar unter https://github.com/ENCODE-DCC/rna-seq-pipeline) wurden Lesevorgänge dem Mausgenom zugeordnet ( mm10) mit STAR align (V2.12). Genomweite Abdeckungsdiagramme wurden mithilfe von Bam-to-Signalen (v2.2.1) erstellt. Genexpressionszählungen wurden für Gencode-M4-Genanmerkungen mithilfe von RSEM (v1.4.1) generiert. Differentialexpressionsanalysen wurden unter Verwendung des DESeq-Programms im R Statistical Package https://bioconductor.org/packages/3.3/bioc/vignettes/DESeq/inst/doc/DESeq.pdf57,58 durchgeführt. Statistisch signifikante differentiell exprimierte Gene für relevante Gewebe für jeden TAD-Grenzlöschort sind in der ergänzenden Abbildung 5 und den ergänzenden Daten 5 aufgeführt. RNA-seq-Experimente wurden an jeweils zwei biologischen Replikaten für homozygote Mutanten sowie an Wildtyp-Kontrollen durchgeführt.

Die quantitative PCR-Analyse wichtiger Entwicklungsgene in der Nähe jeder TAD-Grenze in einer größeren Gruppe von E11.5-Geweben ergab keine zusätzlichen signifikanten Veränderungen in der Genexpression (ergänzende Abbildung 6 und ergänzende Daten 6). Für die umfassende Sammlung gesammelter Gewebe wurde die RNA wie oben beschrieben isoliert und die cDNA mit Omniscript RT (Qiagen-Katalog-Nr. 205111) nach Standardmethoden synthetisiert. qPCR-Assays wurden für mindestens zwei Gene durchgeführt, jedes in TADs, die unmittelbar die gelöschte Grenze flankieren. Taqman-Assay-Reagenzien (Life Technologies) wurden für alle Ziele verwendet, einschließlich der Gene, die zur Normalisierung der Expressionsniveaus verwendet wurden. Taqman-Assays (Roche Applied Science) mit genspezifischen Primersequenzen wurden mithilfe des Online-Algorithmus des Herstellers erstellt und sind in den Zusatzdaten 11 aufgeführt. Alle Amplikons erstrecken sich über Exon-Exon-Verbindungen, um die Amplifikation genomischer DNA zu verhindern. 30-μl-Assays, dispensiert in TaqMan Universal PCR 2X Mastermix (Applied Biosystems), wurden auf LightCycler 480 (Roche) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Alle Ct-Werte wurden manuell überprüft. Die relativen Genexpressionsniveaus wurden unter Verwendung der 2−ΔΔCT-Methode59 berechnet, die auf das Actb-Housekeeping-Gen normalisiert war, und der Mittelwert der Wildtyp-Kontrollproben wurde auf 1 gesetzt. Für jeden Genotyp wurden mindestens drei unabhängige Mutantenproben sowie Kontrollen mit entsprechendem Wurfgeschwister und Stadium bewertet /Zustand. Wir haben keine signifikanten Expressionsänderungen in der Nähe der gelöschten Grenzen B3, B5 und B7 beobachtet. In Anbetracht der Tatsache, dass die RNA-seq-Analyse an Massengewebe zu einem einzigen Entwicklungszeitpunkt durchgeführt wurde, können wir nicht ausschließen, dass Expressionsänderungen auf Teilmengen von in diesen Geweben vorhandenen Zellen beschränkt sind oder zu anderen Entwicklungszeitpunkten stärker ausgeprägt sein können.

Um die Expression von Tbx5 in sich entwickelnden Lungen für Kontroll- und TAD-Grenz-Deletionsmutanten für Locus B2 zu beurteilen, wurde eine Whole-Mount-In-situ-Hybridisierung unter Verwendung von Digoxigenin-markierten Antisense-RNA-Sonden an E11.5-Mäusen (48 Somiten-Stadium) durchgeführt Embryonen nach etablierten Protokollen60,61. Die Proben wurden 15 Minuten lang mit Proteinase K behandelt; Embryonen wurden präpariert, um die Herzen zu entfernen und die Lunge freizulegen, und anschließend mit einem Leica 125 C-Stereomikroskop mit einer Flexacam C1-Kamera abgebildet (ergänzende Abbildung 7).

Direkt relevante Ergebnisse sind in Abb. 4 zusammengefasst. Mutanten und Wildtyp-Kontrollen für vier von acht TAD-Grenzlöschorten (B3, B5, B6 und B7) wurden einer umfassenden Phänotypisierung mithilfe einer standardisierten Pipeline im Mouse Biology Program (MBP) unterzogen. Universität von Kalifornien, Davis. Die Pipeline ist Teil des vom NIH finanzierten Knockout Mouse Phenotyping Project (KOMP2), einem Teilnehmer des International Mouse Phenotyping Consortium (IMPC). Phänotypisierungstests werden von der International Mouse Phenotyping Resource of Standardized Screens (IMPReSS) abgeleitet, https://www.mousephenotype.org/impress36, alle Protokolle und Metadaten sind unter https://www.mousephenotype.org/impress/PipelineInfo zugänglich. Die KOMP2-Phänotypisierung (ergänzende Abbildung 10) und die statistischen Analysemethoden sind standardisiert 37, 38. Ergänzende Daten 7 fassen andere gemeldete statistisch signifikante (p < 0,005) Ergebnisse zusammen. Mutanten und Wildtyp-Kontrollen für die anderen drei TAD-Grenzdeletionsorte (B2, B4 und B8) wurden unter Verwendung von Standardmethoden für Brutto-Nekropsie, Organgewichte und Histopathologie für alle wichtigen Organsysteme am Comparative Pathology Laboratory der University of California, Davis, phänotypisiert .

Transgene Enhancer-Reporter-Assays für den vorhergesagten Lungen-Enhancer (852 bp) wurden in einem ortsspezifischen transgenen Maus-Assay unter Verwendung eines minimalen Shh-Promotors und eines lacZ-Reportergens (ergänzende Abbildung 8) an einem nicht endogenen Safe-Harbor-Locus durchgeführt. Die vorhergesagte Enhancer-Region wurde aus genomischer Maus-DNA PCR-amplifiziert; chr5:120101603–120102454 (mm10), CTGGGCTACAGGAAGTTGGA (Vorwärtsprimer), CAGAGGGCATGAGAGAGACC (Rückwärtsprimer), 852 bp PCR-Amplikon. Das PCR-Amplikon wurde unter Verwendung der Gibson-Assembly (New England Biolabs)62 in einen lacZ-Reportervektor (Addgene #139098) kloniert. Der endgültige transgene Vektor besteht aus der vorhergesagten Enhancer-Promotor-Reporter-Sequenz, flankiert von Homologiearmen, die für die ortsspezifische Integration in den H11-Locus im Mausgenom vorgesehen sind50. Die Sequenz der geklonten Konstrukte wurde sowohl mit Sanger-Sequenzierung als auch mit MiSeq bestätigt. Transgene Mäuse wurden mittels pronukleärer Injektion erzeugt, wie oben für die Erzeugung der TAD-Grenzlöschmäuse beschrieben. F0-Embryonen wurden zur Färbung bei E11,5, E14,5 und E16,5 gesammelt.

Die β-Galactosidase-Färbung wurde auf standardisierte Weise durchgeführt50. Kurz gesagt, die Embryonen wurden in kalter 1 × phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) 30 Minuten lang für E11.5-Embryonen und 60 Minuten lang für E14.5- bzw. E16.5-Embryonen fixiert, während sie bei 30 Minuten gerollt wurden Zimmertemperatur. Die Embryonen wurden in Embryo-Waschpuffer (2 mM Magnesiumchlorid [Ambion, Katalog-Nr. AM9530], 0,02 % NP-40-Ersatz [Fluka, Katalog-Nr. 74385], 0,01 % Desoxycholat [Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. D6750] gewaschen. verdünnt in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,3) dreimal für jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur und überführt in frisch hergestellte X-gal-Färbelösung (4 mM Kaliumferricyanid [Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. P3667], 4 mM Kaliumferrocyanid [ Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. P9387], 20 mM Tris, pH 7,5 [Invitrogen, Katalog-Nr. 15567027], 1 mg ml−1 X-gal [Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. B4252]). Die Embryonen wurden in der Färbelösung über Nacht unter Rollen bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt inkubiert. Die Embryonen wurden dann dreimal 30–60 Minuten pro Waschgang mit 1 × PBS gewaschen und anschließend in 4 % PFA bei 4 °C gelagert. Die Embryonen wurden auf das Vorhandensein des transgenen Konstrukts50 genotypisiert. Für den Vergleich der Reportergenaktivität in den drei getesteten Konstrukten wurden nur Embryonen berücksichtigt, die positiv auf die Transgenintegration in den H11-Locus reagierten und sich im richtigen Entwicklungsstadium befanden. Die genaue Anzahl der Embryonen ist in der ergänzenden Abbildung 8 angegeben.

Statistische Analysen werden ausführlich in den Methoden beschrieben. Für die Mendelschen Verhältnisse wurden systematisch zwischen 18–43 embryonale Proben (TAD-Grenzort B1) und zwischen 101–343 (B1–8) Mäuse im Entwöhnungsstadium gesammelt, und ein Chi-Quadrat-Test wurde verwendet, um signifikante Abweichungen zu bestimmen. Mindestens zwei unabhängige biologische Proben pro Zustand wurden auf RNA-Sequenz analysiert, und mindestens drei unabhängige biologische Proben pro Zustand wurden auf qPCR bei e11,5 analysiert; Ein Likelihood-Ratio-Test (DESeq) und ein T-Test wurden verwendet, um signifikante Unterschiede für die RNA-seq- bzw. qPCR-Ergebnisse zu bestimmen. Für Hi-C-Experimente wurden mindestens zwei unabhängige biologische Proben pro Bedingung analysiert und zur Berechnung der p-Werte wurde ein Wilcoxon-Rangsummentest verwendet. Zwischen 7 und 12 unabhängige postnatale Mäuse pro Zustand wurden in der standardisierten IMPC-Pipeline bewertet, und je nach Bedarf wurden entweder ein Wilcoxon-Rangsummentest, der exakte Fisher-Test oder PhenStat Mixed Model- oder Referenzbereichstests verwendet. Für die TAD-Grenze B2 wurden 20 im Stadium und im Wurf übereinstimmende homozygote Mutanten-Kontroll-Paare auf ihre grobe Lungenmorphologie untersucht. Zwischen 4 und 9 unabhängige biologische Proben wurden für die transgenen In-vivo-Reportertests untersucht, die eine Enhancer-Aktivität in embryonalen Lungen zeigten. Für die Enhancer-, CTCF- und Enhancer+CTCF-spezifischen Deletionen im Zusammenhang mit der TAD-Grenze B2 wurden zwischen 3 und 8 unabhängige Mäuse pro Genotyp auf ihre grobe Lungenmorphologie untersucht. Alle Statistiken wurden geschätzt und Diagramme mit der statistischen Rechenumgebung R Version 2022.12.0 + 353 (www.r-project.org) erstellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Veröffentlichung besprochenen Hi-C- und RNA-seq-Daten wurden im Gene Expression Omnibus63,64 des NCBI hinterlegt und sind über die GEO-Serien-Zugangsnummer GSE172089 zugänglich. Die Quelldaten für Abb. 2 und die ergänzende Abbildung 3 finden Sie in den ergänzenden Daten 4, die für die ergänzende Abbildung 5 finden Sie in den ergänzenden Daten 5 und die für die ergänzende Abbildung 6 finden Sie in den ergänzenden Daten 6. Die Quelldaten für die ergänzenden Daten Die Abbildungen 11–12 sind jeweils in den ergänzenden Abbildungen 13–14 enthalten. Zusätzliche Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des US National Institutes of Health (NIH) für LAP und AV (UM1HG009421) unterstützt. Die Forschung wurde am EO Lawrence Berkeley National Laboratory und im Rahmen des Vertrags DE-AC02-05CH11231 des US-Energieministeriums der University of California (UC) durchgeführt. Die vom UC Davis Mouse Biology Program (MBP) (www.mousebiology.org) durchgeführte Phänotypisierung wurde durch eine NIH-Verwaltungsergänzung zum KOMP2-Stipendium, 3UM1OD023221-07S1, für die Phänotypisierung nichtkodierender Elemente finanziert. Adyam Akeza wurde durch den NIH Bridges to Baccalaureate Program Grant R25GM095401 über UC Berkeley unterstützt. JL-R. wird vom spanischen Ministerio de Ciencia e Innovacion (PID2020-113497GB-I00) unterstützt. Wir danken Renee Araiza und Louise Lanoue für ihre Unterstützung bei der Koordinierung der Arbeit und der Analyse von Phänotypen im MBP-Programm der UC Davis sowie Michael Kosicki vom Berkeley Lab für Hilfe bei der Bioinformatik.

Abteilung für Umweltgenomik und Systembiologie, Lawrence Berkeley National Laboratory, 1 Cyclotron Road, Berkeley, CA, 94720, USA

Sudha Rajderkar, Iros Barozzi, Yiwen Zhu, Yoko Fukuda-Yuzawa, Guy Kelman, Adyam Akeza, Quan Pham, Anne N. Harrington, Janeth Godoy, Eman M. Meky, Kianna von Maydell, Riana D. Hunter, Jennifer A. Akiyama, Catherine S. Novak, Ingrid Plajzer-Frick, Veena Afzal, Stella Tran, Diane E. Dickel, Axel Visel und Len A. Pennacchio

Zentrum für Krebsforschung, Medizinische Universität Wien, Borschkegasse 8a, 1090, Wien, Österreich

Iros Barozzi

Abteilung für Chirurgie und Krebs, Imperial College London, London, Großbritannien

Iros Barozzi

Ludwig Institut für Krebsforschung, La Jolla, CA, USA

Rong Hu, Yanxiao Zhang, Bin Li und Bing Ren

Andalusisches Zentrum für Entwicklungsbiologie (CABD), CSIC-Universidad Pablo de Olavide Junta de Andalucía, 41013, Sevilla, Spanien

Ana Alcaina Caro & Javier Lopez-Rios

Institut für fortgeschrittene Biowissenschaften, Keio-Universität, Tsuruoka, Yamagata, Japan

Yoko Fukuda-Yuzawa

Das Jerusalem Center for Personalized Computational Medicine, Hebräische Universität Jerusalem, Jerusalem, Israel

Guy Kelman

Joint Genome Institute des US-Energieministeriums, 1 Cyclotron Road, Berkeley, CA, 94720, USA

Matthew J. Blow, Axel Visel und Len A. Pennacchio

Zentrum für Genommedizin, Massachusetts General Hospital, Boston, MA, 02114, USA

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Programm für Medizin- und Populationsgenetik und Stanley Center for Psychiatric Disorders, Broad Institute of Harvard und Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, 02142, USA

Michael E. Talkowski

Abteilung für Neurologie, Massachusetts General Hospital und Harvard Medical School, Boston, MA, 02114, USA

Michael E. Talkowski

Mausbiologieprogramm, University of California, Davis, Davis, CA, USA

KC Kent Lloyd

Abteilung für Chirurgie, School of Medicine, University of California, Davis, Davis, CA, USA

KC Kent Lloyd

Zentrum für Epigenomik, University of California, San Diego School of Medicine, La Jolla, CA, USA

Bing Ren

Abteilung für Zelluläre und Molekulare Medizin, University of California, San Diego School of Medicine, La Jolla, CA, USA

Bing Ren

Institut für Genommedizin, Moores Cancer Center, University of California, San Diego School of Medicine, La Jolla, CA, USA

Bing Ren

School of Natural Sciences, University of California, Merced, Merced, CA, USA

Axel Visel

Programm für vergleichende Biochemie, University of California, Berkeley, CA, 94720, USA

Len A. Pennacchio

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SR, IB, DED, AV und LAP haben die Studie entworfen. SR und IB entwickelten die Priorisierungsstrategie zur Identifizierung von TAD-Grenzen für die experimentelle Löschung, IB führte die Korrelationsanalyse mit der Unterstützung von YFY durch. SR, Y. Zhu, AAC, RH, AA, QP, ANH, JG, EMM, KVM, RDH, JAA, CSN, IP-F., VA und ST führten Experimente durch, einschließlich der Erzeugung und Charakterisierung von Knockout-Mäusen. KCKL beaufsichtigte die KOMP2-Phänotypisierungsbemühungen am UC Davis Mouse Biology Program. JL-R. und BR koordinierten und beaufsichtigten Experimente am CABD, CSIC-Universidad Pablo de Olavide Junta de Andalucía, 41013 Sevilla, Spanien, und an der University of California, San Diego School of Medicine, La Jolla, CA, USA. SR, Y. Zhang, BL, GK, MB und MT analysierten Daten. SR, DED, AV und LAP haben das Manuskript mit Beiträgen der übrigen Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Axel Visel oder Len A. Pennacchio.

BR ist Mitbegründer von Arima Genomics, Inc und Epigenome Technologies, Inc. Andere Autoren haben keine konkurrierenden Interessen anzugeben.

Wir haben daran gearbeitet, bei der Auswahl nichtmenschlicher Probanden ein ausgewogenes Geschlechterverhältnis sicherzustellen. Wir haben daran gearbeitet, durch die Auswahl der Genomdatensätze die Vielfalt der experimentellen Proben sicherzustellen. Einer oder mehrere der Autoren dieser Arbeit bezeichnen sich selbst als eine in der Wissenschaft unterrepräsentierte ethnische Minderheit. Einer oder mehrere der Autoren dieses Artikels erhielten Unterstützung durch ein Programm zur Erhöhung der Minderheitenrepräsentation in der Wissenschaft. Während wir für diese Arbeit wissenschaftlich relevante Referenzen zitieren, haben wir uns in unserer Referenzliste auch aktiv für ein ausgewogeneres Geschlechterverhältnis eingesetzt. Die Autorenliste dieses Papiers umfasst Mitwirkende aus dem Ort, an dem die Forschung durchgeführt wurde, die an der Datenerhebung, Gestaltung, Analyse und Interpretation der Arbeit beteiligt waren.

Dieses Manuskript wurde zuvor in einer anderen Nature Portfolio-Zeitschrift rezensiert. Dieses Dokument enthält nur Gutachterkommentare und Gegenschreiben für Versionen, die bei Communications Biology berücksichtigt werden. Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Zhijuan Qiu und George Inglis.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Rajderkar, S., Barozzi, I., Zhu, Y. et al. Für eine normale Genomfunktion sind topologisch assoziierende Domänengrenzen erforderlich. Commun Biol 6, 435 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04819-w

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Eingegangen: 15. Dezember 2022

Angenommen: 06. April 2023

Veröffentlicht: 20. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04819-w

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