HDAC1 und HDAC6 sind für die Wachstumsförderung bei IDH1-mutierten Gliomen von wesentlicher Bedeutung

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12433 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Niedriggradige und sekundäre hochgradige Gliome enthalten häufig Mutationen in den Stoffwechselenzymen IDH1 oder IDH2, von denen angenommen wird, dass sie die Tumorentstehung vorantreiben, indem sie viele der Chromatin-regulierenden Enzyme hemmen, die die DNA-Struktur regulieren. Histon-Deacetylase-Hemmer sind vielversprechende Krebsmedikamente und wurden bereits in klinischen Studien eingesetzt. Es fehlt jedoch ein klares Verständnis ihres Mechanismus oder ihrer Genziele. In dieser Studie analysieren die Autoren genetisch von Patienten stammende IDH1-Mutantenkulturen, um zu bestimmen, welche HDAC-Enzyme das Wachstum von IDH1-Mutantengliomen vorantreiben. Eine Reihe von Patienten-abgeleiteten Gliomasphären-Zelllinien (2 IDH1-Mutantenlinien, 3 IDH1-Wildtyp-Linien) wurden einem Arzneimittelscreening epigenetisch modifizierender Arzneimittel aus verschiedenen epigenetischen Klassen unterzogen. Die Wirkung von LBH (Panobinostat) auf die Genexpression und die Chromatinstruktur wurde an von Patienten stammenden IDH1-Mutantenlinien getestet. Die Rolle jedes der hoch exprimierten HDAC-Enzyme wurde mithilfe lentiviraler RNA-Interferenz-Knockdown-Vektoren und eines vom Patienten abgeleiteten IDH1-Mutanten-In-vitro-Modells des Glioblastoms (HK252) molekular analysiert. Diese Ergebnisse wurden dann in einem In-vivo-Xenotransplantationsmodell (BT-142) bestätigt. Die IDH1-Mutation führt in zwei verschiedenen IDH1-Mutanten-Überexpressionsmodellen zu einer Herunterregulierung des Gens, einer DNA-Hypermethylierung, einer erhöhten DNA-Zugänglichkeit und einer H3K27-Hypoacetylierung. Das Arzneimittelscreening identifizierte Histon-Deacetylase-Inhibitoren (HDACi) und Panobinostat (LBH) insbesondere als die selektivsten Verbindungen zur Hemmung des Wachstums in IDH1-mutierten Gliomlinien. Von den elf annotierten HDAC-Enzymen (HDAC1-11) werden nur sechs in IDH1-mutierten Gliomgewebeproben und von Patienten stammenden Gliomasphärenlinien (HDAC1-4, HDAC6 und HDAC9) exprimiert. Lentivirale Knock-Down-Experimente ergaben, dass HDAC1 und HDAC6 sowohl in vitro als auch in vivo am beständigsten für das Wachstum essentiell sind und auf sehr unterschiedliche Genmodule abzielen. Der Abbau von HDAC1 oder HDAC6 in vivo führte zu einem umschriebenen, weniger invasiven Tumor. Die durch die IDH1-Mutation induzierte Gendysregulation ist weit verbreitet und durch direkte IDH1-Hemmung nur teilweise reversibel. Diese Studie identifiziert HDAC1 und HDAC6 als wichtige und medikamentös ansteuerbare Enzyme, die für das Wachstum und die Invasivität von IDH1-mutierten Gliomen notwendig sind.

Sequenzierungsstudien an minderwertigen Gliomen bei Erwachsenen haben Punktmutationen in den aktiven Stellen der Stoffwechselenzyme IDH1 und IDH2 ergeben, die eine neuartige enzymatische Funktion der Reduktion von Alpha-Ketoglutarat zum Onkometaboliten 2-Hydroxyglutarat (2-HG) verleihen1. Viele Chromatin-regulierende Enzyme (z. B. TET-DNA-Demethylasen und JMJ-Histon-Demethylasen) benötigen Alpha-Ketoglutarat als Co-Faktor und in hohen Konzentrationen kann 2-HG als kompetitiver Inhibitor wirken, der zur DNA- und Histon-Hypermethylierung führt, was zu einer weit verbreiteten Gen-Down-Folge führt. Verordnung2. Seit dieser Entdeckung konzentrierte sich der Großteil der Forschung auf die Wirkung der IDH1- und IDH2-Mutationen auf TET2 und die DNA-Hypermethylierung, sodass Histone relativ wenig untersucht wurden3,4,5. TET2- und IDH-Mutationen kommen bei akuter myeloischer Leukämie6 (AML) häufig vor und schließen sich gegenseitig aus. Tet2- und IDH1-Knockout-Mäuse entwickeln beide spontan Leukämie7,8. Dies deutet darauf hin, dass die IDH1-Mutation im Fall von AML hauptsächlich durch Hemmung der TET2-Funktion wirkt. Der tumorigene Mechanismus der IDH-Mutationen in Gliomen ist jedoch weniger klar. TET2-Mutationen sind bei Gliomen selten und weder Tet2- noch IDH1-Knockout-Mäuse erzeugen spontan Hirntumoren.

Sequenzierungsstudien an histologisch ähnlichen minderwertigen diffusen intrinsischen Ponsgliomen (DIPG) bei Kindern haben eine einzelne Lysin-Methionin-Substitution in der H3-Histon-Untereinheit (H3K27M) ergeben9,10,11. Unter normalen Umständen kann das H3K27-Lysin entweder acetyliert (H3K27ac) oder methyliert (H3K27me3) sein, was zu einer Öffnung bzw. Schließung des Nukleosoms führt11,12. Mausmodelle zeigen, dass die H3K27M-Mutation zu einer erhöhten Histonacetylierung und einer erhöhten Genexpression führt9,10. Interessanterweise zeigten diese Studien auch, dass der Grad der H3K27-Acetylierung mit den intrazellulären Konzentrationen von Alpha-Ketoglutarat korreliert, was zu der Hypothese führte, dass die IDH1/2-Mutationen, die einen Alpha-Ketoglutarat-Abbau verursachen, zu einer entsprechenden H3K27-Deacetylierung führen könnten13.

Nach der Entdeckung der IDH1-Mutation hoffte man, dass die Hemmung dieses mutierten Enzyms und die Verringerung der intrazellulären Konzentrationen von 2-HG zu einer Umkehrung der durch die Mutation verursachten epigenetischen Veränderungen und einem verbesserten Überleben führen könnte. Seitdem wurden mehrere wirksame und hochspezifische IDH1/2-Inhibitoren entwickelt14. Die ersten Ergebnisse klinischer Studien zu AML waren äußerst ermutigend, da sowohl Mausmodelle als auch klinische Studien eine Umkehr epigenetischer Veränderungen und eine verbesserte Überlebensrate zeigten15,16. Leider sind die Daten zu Gliomen uneinheitlicher. Eine erste Studie mit einem mutierten IDH1-Inhibitor in einem Xenotransplantationsmodell ergab eine erhöhte Überlebensrate und Demethylierung des GFAP-Gens17. Eine Folgestudie ergab jedoch nach einer längeren Behandlungsdauer keine Veränderungen im Wachstum oder in der DNA/Histon-Methylierung18. Klinische Studien zu Gliomen waren ebenfalls enttäuschend. Es gab einige Berichte über die Stabilität des Tumors, aber keine Berichte über eine konsistente Schrumpfung des Tumors19. Im Fall von Gliomen scheinen zusätzliche Therapien erforderlich zu sein, um die durch das mutierte Enzym IDH1 induzierte epigenetische Dysregulation umzukehren.

Die Histon-Deacetylase-Familie besteht aus elf Genen (HDAC 1–11) und ist für die Entfernung von Acetylgruppen aus Histonresten, z. B. H3K27, verantwortlich. Histondeacetylasen (HDAC) werden in einer Vielzahl von Krebsarten stark exprimiert und sind in hohem Maße für Medikamente geeignet, was sie zu einem häufigen Thema für Forschungsstudien macht20,21,22,23. Frühe klinische Studien ergaben, dass die Verwendung von Valproinsäure (einem bekannten HDAC-Inhibitor und Medikament gegen Krampfanfälle) mit einer verbesserten Überlebensrate bei Gliompatienten verbunden war24. Folgestudien waren ermutigend, aber gemischt25,26,27,28,29,30. Interessanterweise ergaben drei aktuelle Studien, dass HDAC-Inhibitoren möglicherweise speziell bei IDH1-mutierten Gliomen wirksam sind31,32,33. Histondeacetylasen werden ubiquitär in verschiedenen Zelltypen exprimiert und regulieren mehrere zelluläre Prozesse. Ein wirksames Krebstherapeutikum müsste ein gewisses Maß an Spezifität aufweisen, um das Tumorwachstum bei tolerierbaren Nebenwirkungen zu verlangsamen. In dieser Studie untersuchen wir die Auswirkung der IDH1-Mutation auf die H3K27-Acetylierung und bestimmen, welche HDAC-Gene für das Wachstum in vom Patienten stammenden mutierten IDH1-Gliomzellen essentiell sind.

Kurz nach der Entdeckung der IDH1-Mutation und der hemmenden Wirkung von 2-HG auf Alpha-Ketoglutarat-abhängige Enzyme wurde allgemein angenommen, dass die IDH1-Mutation über eine Chromatin-Dysregulation zur Tumorentstehung führt2,34,35,36. Es wurde auch angenommen, dass die Hemmung der IDH1-Mutation und die 2-HG-Depletion diese Dysregulation umkehren könnten. Während klinische Studien mit mutierten IDH-Inhibitoren laufen, sind die ersten Ergebnisse enttäuschend19. Um diesen Mangel zu beheben und alternative therapeutische Ziele zu finden, begannen wir mit einem Multi-Omics-Ansatz, um die vielfältigen Auswirkungen der IDH-Mutation auf die Chromatinstruktur anhand von zwei zuvor veröffentlichten und validierten Modellen des IDH-Glioms zu charakterisieren: (1) Überexpression der IDH1-Mutante auf E12 embryonale Neurosphären der Maus37. (2) Ein IDH1-Knock-in-Gliommodell der Maus (IDH1WT/NRAS/G12V-shp53, shATRX vs. IDH1mut-R132H, NRAS G12V-sh53, shATRX)38. Maus- und Humanmodelle des mutierten IDH1-Glioms wurden durch Messung der 2-HG-Spiegel validiert (ergänzende Abbildung 1A).

Angesichts der Rolle der H3K27M-Mutation beim diffusen intrinsischen Ponsgliom13 haben wir uns entschieden, uns auf den H3K27-Histonrest zu konzentrieren. In Übereinstimmung mit anderen Berichten führte eine Überexpression des IDH1-Mutantenenzyms in beiden Mausmodellen zu einer Herunterregulierung des Gens und einer DNA-Hypermethylierung (Abb. 1A, B). In beiden Modellen konnten wir auch einen nicht signifikanten Anstieg der DNA-Zugänglichkeit mithilfe von ATAC-seq feststellen (Abb. 1C). Die Auswirkungen des mutierten IDH1-Enzyms auf die H3K27-Methylierung zeigten gleiche Mengen an Hyper- und Hypomethylierung (Abb. 1D). Was die H3K27-Acetylierung betrifft, führte eine Überexpression des mutierten Enzyms IDH1 zu einer Abnahme der Histonacetylierung (Abb. 1E). Eine Reihe chirurgisch resezierter Proben (IDH1-Wildtyp-Gliom N = 4, IDH1-mutiertes Gliom N = 4 und Kontroll-/Epilepsiegewebe N = 4) wurden mit ChIP-seq auf H3K27-Modifikationen (H3K27me3 und H3K27ac) untersucht. Die unbeaufsichtigte Häufung unterschiedlicher Peaks ergab, dass H3K27ac-Peaks (aber nicht H3K27me3-Peaks) IDH1-Wildtyp- und IDH1-Mutantenproben in verschiedene Gruppen aufteilten. Wir konnten jedoch keinen Trend zur Hypoacetylierung in den IDH1-Mutantenproben feststellen (ergänzende Abbildung 1B).

Die IDH1-Mutation führt zu einer Herunterregulierung von Genen, DNA-Methylierung und Histon-Hytonylierung: Es wurden drei E12-Neurosphärenlinien der Maus erzeugt und mit einem mutierten IDH1-Überexpressionsvektor („E12-Neurosphären“) infiziert37. Zusätzlich wurden Zelllinien aus explantierten Maustumoren eines zuvor veröffentlichten IDH1-mutierten Mausgliommodells („Nunez et al.38“) erstellt. (A) IDH1-Wildtyp- und IDH1-Mutantenlinien wurden mithilfe einer RNA-Seq-Analyse verglichen und zeigten, dass IDH1-Mutantenproben mit einer Gen-Herunterregulierung verbunden sind. (B) IDH1-Wildtyp- und IDH1-Mutantenlinien (N = 3 Linien) muriner E12-Neurosphärenlinien wurden einer reduzierten Bisulfitsequenzierung unterzogen und die Anzahl der methylierten Inseln wurde gezählt, was frühere Erkenntnisse bestätigt, dass IDH1-Mutantenproben mit Hypermethylierung verbunden sind. (C) E12-Neurosphären (N = 3) und Nunez et al. Das Gliommodell (N = 1) wurde einer ATAC-seq-Analyse unterzogen und ergab einen nicht signifikanten Trend für IDH1-Mutantenproben, mehr Peaks aufzuweisen. (D,E) E12-Neurosphären (N = 3) und Nunez et al. Gliomzelllinien (N = 3) wurden einer ChIP-seq mit Antikörpern gegen H3K27me3 (D) und H3K27ac (E) unterzogen, was zeigte, dass die IDH1-Mutation mit einer H3K27-Hypoacetylierung und einem moderateren Trend zur H3K27-Hypomethylierung verbunden ist.

Wie aus den vorherigen Ergebnissen hervorgeht, hat die IDH-Mutation mehrere Auswirkungen auf verschiedene Aspekte der Chromatinstruktur. Um festzustellen, welche dieser Effekte für das Wachstum essentiell und möglicherweise medikamentös zielgerichtet sind, führten wir ein Arzneimittelscreening von 106 chromatinmodifizierenden Verbindungen durch. Frühere Studien deuten darauf hin, dass endogene serumfreie Gliomsphärenlinien das genaueste In-vitro-Modell sind39 und daher verwendeten wir fünf vom Patienten abgeleitete Linien (IDH1-Mutant-25240, BT14241, IDH1-Wildtyp-357, 385, 41240). Für jedes Arzneimittel wurde die Fläche unter der Kurve (AUC) berechnet (ergänzende Abbildung 2A, B). Die Arzneimittel wurden nach ihrer Selektivität für IDH1-Mutantenlinien eingestuft. Vier der acht Verbindungen, die für IDH1-Mutantenkulturen am selektivsten waren, waren Histon-Deacetylase-Inhibitoren (HDACi). Interessanterweise wurde von einer anderen Gruppe unabhängig bestätigt, dass Triptolid, die zweitselektivste Verbindung, gegen IDH1-mutierte Gliomzellen wirksam ist42. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das mutierte IDH1-Enzym Histone deacetyliert und dass die Histondeacetylasen möglicherweise essentielle und medikamentenzielgerichtete Funktionen bei mutierten IDH-Gliomen tragen.

Mit der Erkenntnis, dass Histon-Deacetylase-Inhibitoren vielversprechende Therapeutika sein könnten, führten wir einen Multi-Omics-Ansatz durch, um die Wirkung von HDAC-Inhibitoren auf die Chromatinstruktur von IDH1-mutierten Gliomen zu bestimmen. Als ersten Validierungsschritt bestätigten wir, dass eine Sammlung von von Patienten stammenden IDH1-Mutantenlinien die in ihren Elterntumoren beobachtete Gen-Herunterregulierung und DNA-Hypermethylierung rekapitulierte (Abb. 2A, B). In Übereinstimmung mit anderen veröffentlichten Berichten18 hatten die pharmakologische Hemmung (c227) und der genetische Knock-down (shIDH1) des mutierten IDH1-Proteins nur geringe Auswirkungen auf die Genexpression (Abb. 2C). Im Gegensatz dazu zeigte die Behandlung mit Panobinostat (LBH) sowie Valproinsäure (ein bekanntes und klinisch eingesetztes Antiepileptikum und HDAC-Inhibitor) eine weit verbreitete Gen-Hochregulierung (Abb. 2D) und insbesondere eine signifikante Hochregulierung von veröffentlichte herunterregulierte und methylierte Gene (z. B. Noushmehr-Gene43) (Abb. 2E). Basierend auf der ATAC-seq-Analyse wurde auch ein Anstieg der DNA-Zugänglichkeit beobachtet (Abb. 2F). Die Differenzialanalyse der CUT&RUN-Peaks zeigte, dass die LBH-Behandlung zu einer verringerten Anzahl von H3K27me3-Peaks und einem geringeren Anstieg der H3K27ac-Peaks führte. Die Western-Blot-Analyse zeigte einen dosisabhängigen Anstieg der gesamten H3K27-Acetylierung, was darauf hindeutet, dass bestehende H3K27-Loci möglicherweise zusätzlich acetyliert werden, anstatt neue Loci zu erzeugen (ergänzende Abbildung 1C – E). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Histon-Deacetylase-Inhibitoren die genetische Herunterregulierung, die mit dem mutierten IDH1-Gen einhergeht, wirksamer umkehren können als die Hemmung der IDH-Mutante.

HDAC-Inhibitoren führen zu einer Gene-Up-Regulation in endogenen IDH1-Mutantenzelllinien. (A) Drei IDH1-Wildtyp-Linien (233, 381, 285) und drei IDH1-Mutantenlinien (252, 213, 322) wurden einer reduzierten Bisulfit-Sequenzierung unterzogen, was zeigt, dass IDH1-mutierte Gliomasphären im Einklang mit den Elterntumoren hypermethyliert sind. (B) Zuvor veröffentlichte Microarray-Daten40 aus unserer Sammlung von Patientenlinien zeigten, dass IDH1-Mutantenlinien ein ausgeprägtes Expressionsprofil der Gen-Herunterregulierung aufweisen. (C) Fünf IDH1-Mutantenlinien (322, 207, 320, 213 und 252) wurden einem lentiviralen Knockdown und einer pharmakologischen Hemmung des IDH1-Mutantenenzyms unterzogen. Es wurde eine Heatmap der unterschiedlich exprimierten Gene zwischen IDH1-Mutanten- und IDH1-Wildtyp-Proben erstellt. Es zeigte sich, dass weder die pharmakologische Hemmung noch der Abbau einen signifikanten Einfluss auf die Genexpression hatten. (D) Im Gegensatz dazu führen zwei bekannte Histon-Deacetylase-Inhibitoren (Valproinsäure und Panobinostat) weltweit zu einer signifikanten Hochregulierung von Genen. (E) Eine signifikante Hochregulierung von Genen wurde auch in einem bekannten, zuvor veröffentlichten Satz herunterregulierter methylierter Gene (z. B. Noushmehr-Gene) beobachtet. (F) In Übereinstimmung mit dieser Gen-Hochregulierung zeigen die ATAC-seq-Daten, dass die Behandlung mit 1 mM Valproinsäure die offenen DNA-Regionen über mehrere IDH1-Mutantenzelllinien hinweg vergrößerte.

Klinische Studien zur Untersuchung der Auswirkungen unspezifischer Pan-HDAC-Inhibitoren auf IDH-WT-Gliome wurden durch unspezifische Toxizität eingeschränkt20,21,22,44. Es gibt elf dokumentierte Histon-Deacetylasen im Säugetiergenom (HDAC1–11). Durch die Bestimmung, welche dieser HDAC-Gene für das Wachstum am entscheidendsten sind, sollte es möglich sein, spezifischere HDAC-Inhibitoren zu identifizieren, die möglicherweise das Wachstum mit geringeren Nebenwirkungen verlangsamen können. Als ersten Schritt haben wir ermittelt, welche HDAC-Gene in IDH1-mutierten Gliomen stark exprimiert werden. Zehn Gliomproben (5 IDH1-Wildtyp und 5 IDH1-Mutante) wurden mithilfe intern validierter Antikörper (HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6 und HDAC7) auf verschiedene HDAC-Gene gefärbt und von einem verblindeten Neuropathologen (AK) bewertet. Zusätzliche Tests mehrerer Anbieter konnten keine spezifische Färbung mit Antikörpern für HDAC8–11 feststellen. Diese Daten wurden durch RNA-Expressionsdaten aus unserer Sammlung von von Patienten stammenden Gliomlinien ergänzt. Die Färbung chirurgischer Proben und Expressionsdaten zeigten eine hohe Expression von HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4 und HDAC6 auf RNA- und Proteinebene (Abb. 3A, B). Lentivirale Vektoren mit kurzer Haarnadelinterferenz (shRNA) wurden gegen die hochexprimierten HDAC-Gene erhalten und in drei endogenen IDH1-Mutantenlinien (211, 252 und BT-142) getestet. Die Zellen wurden in gleicher Dichte ausplattiert, mit Lentivirus infiziert und dann am 14. Tag gezählt. Die Knock-down-Effizienz sowie die Möglichkeit einer Genkreuzregulation wurden mit RNA-Seq-Analyse und Western Blot getestet (ergänzende Abbildung 3A – D). . Gegen HDAC1 und HDAC6 gerichtete Lentiviren verzeichneten den stärksten Rückgang der Zellzahl (Abb. 3C). Zwei weitere unabhängige Konstrukte gegen HDAC1 und HDAC6 wurden getestet, um unspezifische Effekte auszuschließen und ein verringertes Wachstum zu bestätigen (ergänzende Abbildung 3E).

HDAC1 und HDAC6 sind für das Wachstum in einer Reihe von IDH1-Mutantenlinien essentiell. (A) Eine Gruppe von 10 chirurgischen Proben (5 IDH1-Wildtyp und 5 IDH1-Mutante) wurden mit Antikörpern gegen HDAC-Proteine (HDAC1-7) gefärbt und von einem verblindeten Neuropathologen auf einer Skala von 1–3 bewertet. (B) Eine Sammlung von 58 von Patienten stammenden Zelllinien (53 IDH1-Wildtyp, 5 IDH1-Mutante) wurde einer Expressionsanalyse unterzogen und die relative Expression jedes HDAC-Gens wird gezeigt. (C) Knock-down-lentivirale Ventoren wurden gegen die 6 HDAC-Gene entwickelt, die in IDH1-mutiertem Gliomgewebe und Zelllinien (HDAC1-4, HDAC6, HDAC9) exprimiert und an drei IDH1-mutierten Linien getestet wurden. Das relative Wachstum wurde am 14. Tag gemessen.

Um den genetischen Beitrag jedes HDAC-Gens zu analysieren, wurde die Linie HK252 mit jedem der lentiviralen HDAC-Knockdowns (HDAC1–4, HDAC6 und HDAC9) infiziert, bevor sie einer RNA-Seq-Analyse unterzogen wurde. Die Expressionsdaten von jedem Knock-Down wurden mit einem leeren Vektor verglichen. Differenziell exprimierte Gene wurden einer Gen-Set-Anreicherungsanalyse unterzogen. Die Anzahl der hochregulierten und herunterregulierten Gene ist aufgetragen (Abb. 4A, ergänzende Abb. 3F, G). Trotz der früheren Feststellung, dass Pan-Histon-Deacetylase-Inhibitoren zu einer weit verbreiteten Hochregulierung von Genen führen (Abb. 2D), deuten Daten aus den einzelnen Knockdowns darauf hin, dass die HDAC-Gene sowohl aktivierende als auch repressive Funktionen haben (Abb. 4A). Die Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA) ergab einen großen Satz von Genmodulen, die durch die HDAC-Gene positiv reguliert wurden (Abb. 4B). Die meisten dieser angereicherten Gensätze überlappten sich stark und beinhalteten DNA-Replikation und Chromosomenteilung, mit Ausnahme von HDAC6, bei dem es sich um Gensätze handelte, die an der extrazellulären Matrix und Adhäsion beteiligt waren (Abb. 4B). Um die unterschiedlichen Expressionsergebnisse in den medikamentenbehandelten (LBH und VPA) und HDAC-Knockdown-Proben in Einklang zu bringen, wurde HK 252 erneut 5 Tage lang mit 1 mM VPA oder 3 Tage lang mit 15 nM LBH behandelt, bevor es einer RNA-Seq-Analyse unterzogen wurde. Die resultierenden Datensätze wurden einer PCA-Analyse unterzogen, die zeigte, dass die HDAC-Knockdowns und die mit Arzneimitteln behandelten Proben getrennt gruppiert waren (Abb. 4D). Mithilfe bioinformatischer Methoden zur Analyse der nach einer medikamentösen Behandlung beobachteten Genveränderungen wurde jede signifikante Genveränderung (zweifache Veränderung), die nach einer medikamentösen Behandlung beobachtet wurde, einer der folgenden Gruppen zugeordnet: einzigartig für ein HDAC-Gen, „nicht eindeutig“ (d. h. häufig). zu mehr als einem HDAC-Gen) oder „nicht berücksichtigt“ (dh das Gen wurde bei keinem der HDAC-Knockdowns gesehen). Im Anschluss an diese Analyse wurde festgestellt, dass der Großteil der herunterregulierten Gene, die in den mit Medikamenten behandelten Proben beobachtet wurden, auf eines oder mehrere der HDAC-Gene zurückzuführen sein könnte, wobei HDAC6 den größten Beitrag leistete. Im Gegensatz dazu konnten die meisten hochregulierten Gene in den mit Arzneimitteln behandelten Proben nicht mit den verfügbaren HDAC-Knockdown-Daten erklärt werden, was darauf hindeutet, dass möglicherweise komplexere Wechselwirkungen beteiligt sind (Abb. 4C).

HDAC-Enzyme regulieren DNA-Replikationsgenmodule hoch. HDAC6 zielt auf einen einzigartigen Satz von Genmodulen ab. (A) Jeder HDAC-Knockdown wurde einer RNA-Seq-Analyse unterzogen. Die Anzahl der hochregulierten und herunterregulierten Gene wird angezeigt. (B) Diese Gene wurden einer Gen-Set-Anreicherungsanalyse (Panther) unterzogen. Die am stärksten angereicherten Module für jeden Knockdown werden angezeigt. (C) Eine Liste signifikant veränderter (> 2-fach veränderter) Gene aus jedem der Datensätze zur Arzneimittelbehandlung wurde einer der folgenden Untergruppen zugeordnet: (1) einzigartig für einen der HDAC-Knockdown-Sets, (2) „ nicht eindeutig“, d. h. von mehr als einem HDAC-Knockdown-Gensatz gemeinsam genutzt, oder (3) „nicht erfasst“, wenn das Gen in keinem der HDAC-Knockdown-Gensätze gefunden wurde. (D) RNA-seq-Datensätze von jedem Knockdown sowie Arzneimittelbehandlungsproben (1 mM VPA und 15 nM LBH) wurden einer PCA-Analyse (HK252) unterzogen.

Im Anschluss an die In-vitro-Wachstumsdaten wurden BT-142-Zellen mit einem von drei lentiviralen Konstrukten (leerer Vektor/shControl, shHDAC1, shHDAC6) infiziert, bevor sie in das Striatum von nod-SCID-gamma-Nullmäusen injiziert wurden (10.000 Zellen/Maus). , N = 5 Mäuse pro Kohorte). Mäuse wurden eingeschläfert, sobald neurologische Symptome auftraten. shHDAC1-Mäuse zeigten einen signifikanten Überlebensvorteil gegenüber shControl. shHDAC6 zeigte einen Trend zu einer Verbesserung des Überlebens, der keine statistische Signifikanz erreichte (Abb. 5A). Interessanterweise zeigten die phänotypischen Beobachtungen, dass shControl-Mäuse dazu neigten, Anfallssymptome zu entwickeln, während shHDAC1 und shHDAC6 Schwäche- und Gewichtsverlustsymptome entwickelten (Abb. 5B). Nach der Euthanasie wurden die Gehirne entnommen, geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Die Objektträger wurden dann von einem verblindeten Neuropathologen (MH) bewertet, der feststellte, dass shControl-Tumoren invasiver waren als shHDAC1- und shHDAC6-Tumoren (Abb. 5B, C.). Die bisherigen Ergebnisse identifizieren HDAC6 als potenzielles spezifisches Ziel für IDH1-mutierte Gliome. Um diese Hypothese zu testen, wurden zwei berichtete spezifische HDAC6-Inhibitoren (10 μM Ricolinostat, 10 μM ACY-738) an einer Reihe mutierter IDH1-Gliomlinien getestet und zeigten eine hohe Wirksamkeit gegen diese Linien (Abb. 5D).

HDAC1 und HDAC6 fördern die Invasivität in einem In-vivo-Modell des mutierten IDH1-Glioms. (A) 10.000 BT-142-Zellen, die mit den folgenden lentiviralen Konstrukten (shControl, shHDAC1 und shHDAC6) infiziert waren, wurden in den Schwanz von NSG-Mäusen implantiert und durften wachsen, bis sich Symptome entwickelten (N = 5 pro Kohorte). (B) Neurologische Symptome wurden aufgezeichnet (z. B. „Gewichtsverlust“, „Anfälle“) und nach der Entwicklung der Symptome wurden die Mäuse eingeschläfert. Nach der Euthanasie wurden die Gehirne entnommen, geschnitten, mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und von einem verblindeten Neuropathologen (MH) als „Invasiv“, „Nicht-invasiv“ oder „Kein Tumor gesehen“ eingestuft. (C) Repräsentative Abschnitte werden angezeigt. (D) Angesichts der wichtigen Rolle von HDAC6 bei IDH1-Mutantengliomen wurden zwei HDAC6-Inhibitoren (10 μM Ricolinostat, 10 μM ACY-738) sieben Tage lang an einer Gruppe von vier IDH1-Mutantengliomlinien getestet, um die Auswirkung auf die Zellzahl zu bestimmen.

Obwohl es sich nur um eine einzelne Aminosäuresubstitution handelt, hat die R132H-IDH1-Mutation mehrere weitreichende Auswirkungen auf die Immunogenität, den Stoffwechsel und den epigenetischen Zustand der Zelle. Angesichts dieser Veränderungen des Zellverhaltens ist es verlockend, eine spezifische Therapie zu entwickeln, die diese zellulären Effekte nutzen könnte. Studien deuten darauf hin, dass die IDH1-Mutation die erste Mutation sein könnte, die die Tumorentstehung initiiert und somit in jeder Tumorzelle vorhanden ist45. Dies macht es zu einem vielversprechenden Impfstoffziel und zu diesem Zweck laufen derzeit klinische Impfstoffstudien46,47. Dieser Strategie entgegenzuwirken ist der Beweis, dass die IDH1-Mutation und 2-HG immunsuppressiv wirken und eine Immunantwort abschwächen können48,49. Obwohl es sich um ein Onkogen handelt, verursacht das mutierte Enzym IDH1 eine erhebliche Stoffwechselbelastung auf zahlreichen Zellwegen. Spätere Überexpressions-50 und Maus-Knock-in-Studien51 ergaben, dass die IDH1-Mutation zu langsamerem Wachstum und Zelltod führt. Dies bietet die Möglichkeit, diese Schwachstellen auszunutzen. Seltzer et al.52 fanden heraus, dass das mutierte Enzym IDH1 die zellulären Glutamatvorräte erschöpft und Zellen anfällig für Glutaminaseinhibitoren macht. Tateishi et al.18 fanden heraus, dass das mutierte Enzym IDH1 der Zelle NAD+ entzieht, wodurch Zellen anfällig für die NAMPT-Hemmung werden. Die Wirksamkeit der Strahlung auf mutierte IDH1-Tumoren ist umstritten53 und In-vitro-Studien zur Wirkung der IDH1-Mutation auf DNA-Reparaturwege und Strahlenempfindlichkeit sind gemischt3,37,38,54. Während der tumorerzeugende Mechanismus der IDH1-Mutation nie endgültig bewiesen wurde, ist die am meisten akzeptierte Hypothese, dass die 2-HG-basierte Hemmung von Chromatin-modifizierenden Enzymen zu einer pathologischen Genexpression führt55,56. Während zunächst die Hoffnung bestand, dass die Hemmung des mutierten Enzyms IDH1 diese Veränderungen umkehren könnte, kamen diese und andere Studien zu dem Ergebnis, dass die Auswirkungen auf die Genexpression und das Wachstum nicht überzeugend sind19. Der Zweck der aktuellen Studie besteht darin, zusätzliche Verbindungen zu finden, die möglicherweise einige der durch die IDH1-Mutation verursachten pathologischen epigenetischen Veränderungen umkehren könnten. Zu diesem Zweck identifizierte ein unvoreingenommenes Arzneimittelscreening LBH/Panobinostat, einen Pan-HDAC-Inhibitor, als den selektivsten Wirkstoff gegen IDH1-mutierte Gliomlinien. Folgeexperimente ergaben, dass LBH viele der unterdrückten Gene hochreguliert und die Zugänglichkeit von Chromatin erhöht.

Der DNA-Methylierungsstatus des MGMT-Promotors in Gliomen war der erste klinisch verwendete epigenetische Biomarker und seitdem liegt der Schwerpunkt der Gliom-Epigenetik hauptsächlich auf der DNA-Methylierung. Die Entdeckung der H3K27M-Mutation in diffusen intrinsischen Ponsgliomen hat jedoch die Bedeutung der Histonmodifikation und des H3K27-Locus speziell für die Gliomagenese hervorgehoben. Während der genaue Mechanismus der H3K27M-Mutation nicht bekannt ist, zeigen Maus-Knock-in-Modelle, dass die H3K27M-Mutation mit einer Histon-Hyperacetylierung verbunden ist und interessanterweise nicht mit der R132H-IDH1-Mutation kompatibel ist13. Chung et al. berichteten auch, dass der Grad der H3K27-Acetylierung mit dem Alpha-Ketoglutarat-Spiegel korrelierte. Es ist bekannt, dass das mutierte IDH1-Enzym den zellulären Spiegel an Alpha-Ketoglutarat verringert37 und daher ist zu erwarten, dass dies zu einer Hypoacetylierung von H3K27 führen würde. In der aktuellen Studie verwendeten wir zwei IDH1-Überexpressionsmodelle, um die Wirkung des mutierten IDH1-Enzyms auf Chromatin zu bestimmen. Ähnlich wie in früheren Berichten stellten wir fest, dass die IDH1-Mutation mit einer Herunterregulierung von Genen, einer DNA-Hypermethylierung43 und einem nicht signifikanten Trend zu einer erhöhten DNA-Zugänglichkeit verbunden war57. In Übereinstimmung mit unserer Vorhersage war die IDH1-Mutation mit einer H3K27-Hypoacetylierung verbunden. Entgegen den Vorhersagen aus anderen In-vitro-Überexpressionsstudien konnten wir keine erhöhte H3K27-Hypermethylierung beobachten (Abb. 1D). Dafür gibt es mehrere Erklärungen. Eine Erklärung ist, dass in früheren Studien Western Blots verwendet wurden, mit denen die Gesamtmenge an H3K27me3-Molekülen gemessen wurde, während wir in dieser Studie ChIP-seq verwendeten, mit dem die Anzahl der H3K27me3-Loci gemessen wurde. Es könnte sein, dass die IDH1-Mutation zu einer stärkeren Ablagerung von H3K27me3 führt, ohne dass zusätzliche methylierte Loci entstehen. Ein ähnliches Phänomen wurde bei DIPG beobachtet, wo die H3K27M-Mutation zu einer Histon-Hyperacetylierung, aber zu keinen neuen Enhancer-Stellen führte 11.

Im Allgemeinen kommt diese Studie zu dem Schluss, dass das Ausmaß der Auswirkungen auf die H3K27-Modifikation deutlich geringer ist als die Auswirkungen auf die DNA-Methylierung. Die relative Größe des Effekts kann jedoch seine biologische Bedeutung verbergen. Es wird angenommen, dass DNA-Methylierungsänderungen langsam sind und mehrere Zellteilungen erfordern34. In Studien wurde die Möglichkeit untersucht, den Methylierungszustand von IDH1-Gliomen durch Hemmung der DNMT-Familie von DNA-Methylasen mit Decitabin wiederherzustellen58. Obwohl die Therapie letztendlich wirksam ist, ist sie langsam und weist eine unspezifische Toxizität außerhalb des Ziels auf. Im Gegensatz dazu hat die gezielte Ausrichtung auf die Histonarchitektur das Potenzial, eine schnellere Wirksamkeit bei geringerer Toxizität zu erzielen. In Übereinstimmung mit dieser Idee ergab die Untergruppenanalyse der Stupp59-Studie, dass die Verwendung von Valproinsäure (einem bekannten HDAC-Inhibitor) mit einer verbesserten Überlebensrate verbunden war24. Folgestudien zur Untersuchung der Überlebensvorteile von Valproinsäure bei Gliomen waren gemischt, aber im Allgemeinen ermutigend25,26,27,28,29,30. Es ist zu beachten, dass in diesen Studien gemischte Populationen von IDH1-Wildtyp- und IDH1-mutierten Gliomen verwendet wurden, wobei der IDH1-Wildtyp wahrscheinlich die Mehrheit darstellte. Kürzlich haben drei Studien unsere Erkenntnisse bestätigt, dass HDAC-Inhibitoren eine spezifische Wirksamkeit gegen IDH1-Mutantengliome haben31,32,33, was eine Begründung für eine klinische Folgestudie liefert, die auf die Untergruppe der IDH1-Mutanten beschränkt ist. Interessanterweise waren klinische Studien der Phasen I und II mit neueren nicht-selektiven Pan-HDAC-Inhibitoren (z. B. Vorinostat22,60, Panobinostat44 und Romidepsin61) weniger ermutigend, ohne nachgewiesene Wirksamkeit und dosislimitierende Nebenwirkungen. Die Histon-Deacetylase-Aktivität ist wahrscheinlich für die Zellfunktion von wesentlicher Bedeutung, und eine nicht selektive Hemmung aller Histon-Deacetylasen wird wahrscheinlich mit unerwünschter Toxizität verbunden sein. Um dieser Einschränkung zu begegnen, identifiziert diese Studie die spezifischen Mitglieder der HDAC-Familie, die für das Wachstum von IDH1-mutierten Gliomen essentiell sind (dh HDAC1 und HDAC6). Während sich viele der HDAC-Zielgene und Genmodule stark überlappten, schien HDAC6 auf einzigartigere Gene und Genmodule abzuzielen. Die einzigartige Struktur und Genziele des HDAC6-Enzyms eignen sich für spezifische Inhibitoren, und in klinischen Studien wurden mehrere spezifische HDAC6-Inhibitoren als Antikrebsmittel entwickelt (clinicaltrials.gov NCT03008018, NCT02935790, NCT01323751).

Diese Studie weist mehrere Einschränkungen und unerwartete Ergebnisse auf, die erwähnt werden sollten. Erstens ist BT-142 eine der wenigen mutierten IDH1-Zelllinien, die in immungeschwächte Mäuse transplantiert werden. Allerdings ist die Zelllinie hemizygot für die IDH1-Mutation und produziert daher geringere Mengen an 2-HG. Dennoch ähnelt sein Genexpressionsmuster immer noch dem anderer IDH1-Mutantenlinien. Zweitens scheinen die in dieser Studie verwendeten IDH1-Mutantenlinien trotz zahlreicher Versuche resistent gegen CRISPR-Manipulationen zu sein, was genetische Rettungsexperimente zu einer Herausforderung macht. Interessanterweise schien die Überexpression des mutierten IDH1-Enzyms zwar die Anzahl der H3K27-acetylierten Loci zu verringern, es gab jedoch eine beträchtliche Variabilität zwischen den Proben, was darauf hindeutet, dass diese Hypoacetylierung durch zusätzliche, nicht identifizierte Variablen beeinflusst werden könnte. Diese Möglichkeit wird dadurch gestützt, dass wir in einer Gruppe von IDH1-Wildtyp-, IDH1-Mutanten- und epilepsiechirurgischen Proben keine konsistente Histonacetylierungssignatur sahen. Im Gegensatz dazu ist das Signal für die DNA-Methylierung viel stärker und chirurgische Proben scheinen eine konsistentere DNA-Methylierungssignatur aufzuweisen43. In anderen Studien wurde eine Transkriptionsrepressoraktivität mit Histondeacetylasen identifiziert. Diese Studie ergab jedoch, dass in einem IDH1-Mutantengliommodell (HK252) die HDAC-Gene eine Reihe von Chromosomenorganisations- und DNA-Replikationsgenmodulen aktivieren. Interessanterweise zeigten die Expressionsdaten von Histon-Deacetylase-Inhibitoren eine Reihe hochregulierter Gene, die bei den HDAC-Knockdowns nicht zu sehen waren. Eine mögliche Erklärung für diese Beobachtung ist, dass es aufgrund der Hemmung mehrerer HDAC-Proteine durch HDAC-Inhibitorverbindungen zu kombinatorischen Effekten kommen kann, die in Einzelgen-Knockdown-Experimenten nicht beobachtet werden. Im Einklang mit dieser Möglichkeit steht die Beobachtung, dass viele der HDAC-Enzyme redundant sind und sich daher gegenseitig kompensieren können62. Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass HDAC-Enzyme neben der Histon-Deacetylierung (z. B. Proteinmodifikation) mehrere biologische Funktionen haben. Der Abbau von Genen und die Hemmung von Enzymen würden diese Mechanismen wahrscheinlich unterschiedlich beeinflussen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Histon-Deacetylase-Inhibitoren eine vielversprechende Therapie für mehrere Krebsarten darstellen. Jüngste Medikamententests haben gezeigt, dass IDH1-mutierte Gliome möglicherweise besonders empfindlich auf diese Verbindungen reagieren. Der Schlüssel zum Erfolg liegt in einer maßgeschneiderten Behandlung, die das Tumorwachstum verlangsamt und gleichzeitig dosislimitierende Toxizitäten vermeidet.

Ein Arzneimittelscreening von 106 bekannten epigenetischen Verbindungen, die auf 35 Gene und 19 epigenetische Mechanismen abzielen (z. B. DNA-Methylierung, DNA-Demethylierung, Histonmethylierung, Histondemethylierung, Histonacetylierung und Histondeacetylierung), wurde gegen zwei IDH1-Mutanten (252 und BT-142) und drei durchgeführt IDH1-Wildtyp-Linien (357, 385, 412) bei vier Wirkstoffkonzentrationen (10 nM, 100 nM, 1 μM, 10 μM) für 3 Tage. Die Anzahl lebensfähiger Zellen wurde durch MTT geschätzt. Die durchschnittliche Lebensfähigkeit von IDH1mut wurde mit der durchschnittlichen Lebensfähigkeit von IDH1WT verglichen und als Fläche unter der Kurve (IDH1WT/IDH1mut) angezeigt. Die Medikamente wurden dann nach ihrer Verbindung geordnet.

Zeitlich trächtige Muttertiere (C56Bl) wurden auf E12 getötet. Die Embryonen wurden aus der Gebärmutter entfernt und die Kortizes wurden freipräpariert. Drei verschiedene Linien wurden jeweils erzeugt, indem drei Kortizes pro Linie zerkleinert und in serumfreie Neurosphärenmedien gelegt wurden63, bis Neurosphären erschienen. Diese drei neuralen Vorläuferlinien wurden dann entweder mit einem mutierten IDH1-Lentivirus37 oder einer pUltra-Kontrolle infiziert. Die 2-HG-Spiegel dieser Linien sowie anderer IDH1-Mutantenlinien wurden wie zuvor beschrieben durch LC-MS bestätigt37. Diese Linien wurden dann zwölf Passagen lang in Kultur gehalten, bevor sie auf RNA-seq, ATAC-seq, Methyl-seq und Chip-seq (H3K27ac, H3K72me und IgG) verarbeitet wurden.

Lentivirale Plasmide mit Haarnadel-RNA-Sequenzen gegen HDAC-Gene wurden von Sigma erhalten und zur Erzeugung lentiviraler Partikel verwendet (HDAC1:CGGTTAGGTTGCTTCAATCTA/TATCCCGTAGGTCCCCAGT, HDAC2:CAGTCTCACCAATTTCAGAAA, HDAC3:CAAGAGTCTTAATGCCTTCAA, HDAC4:GCCAAAGATGACTTCCCTCTT HDAC6:CGGTAATGGAACTCAGCACAT). / AACCGCAAGCTGCATCCTG, HDAC9: CAAACTGCTTTCGAAATCTAT). 200.000 Zellen wurden in 2 ml serumfreiem Medium mit 12 µl lentiviraler Partikel inkubiert. Nach 24 Stunden wurde der Überstand entfernt und durch Neurosphärenmedium ersetzt. 48 Stunden später wurde das Medium durch frisches Neurosphärenmedium, ergänzt mit 0,5 ug/ml Puromycin, ersetzt. Der Knockdown wurde anhand von RNA-seq und Western Blots bestätigt (ergänzende Abbildung 3A, B). Western Blots wurden aus Gründen der Übersichtlichkeit beschnitten. Es werden Diagramme in voller Länge gezeigt, um die Antikörperspezifität zu demonstrieren (ergänzende Abbildungen 3C, D). Basierend auf vorläufigen In-vitro-Experimenten wurden Arzneimitteldosen von 15 nM LBH und 1 mM VPA gewählt, um eine Zelllebensfähigkeit von ~ 60 % zu erreichen. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Zellen 3 Tage lang medikamentös behandelt. Die Zellen wurden 7 Tage lang mit den HDAC6-Inhibitoren, 10 μm Ricolinostat oder 10 μM ACY-738 behandelt. Alle HDAC-Antikörper wurden von Cell Signaling Technologies erhalten (HDAC1 10E2, HDAC2, 3F3, HDAC3 7G6C5, HDAC4 D15C3, HDAC6 D2B10).

Alle menschlichen Proben wurden vom Biorepository der University of Cincinnati in nicht identifizierter Weise bereitgestellt und vom örtlichen IRB als „Keine menschliche Forschung“ gekennzeichnet. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Alle Daten sind verfügbar unter: https://github.com/TroyCarnwath/garrett_lab.

ATAC-seq-Bibliotheken wurden wie zuvor beschrieben erstellt64. Kurz gesagt, 50.000 Zellen wurden 5 Minuten lang bei 500 × g und 4 °C zentrifugiert. Die Zellen wurden in ATAC-Resuspensionspuffer, der 0,1 % NP40, 0,1 % Tween-20 und 0,01 % Digitonin enthielt, resuspendiert und 3 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden mit ATAC-Resuspensionspuffer gewaschen, der 0,1 % Tween-20 enthielt. Die Kerne wurden 10 Minuten lang bei 4 °C und 500 × g pelletiert. Die Kerne wurden in einem Transpositionsreaktionsgemisch resuspendiert, das TD 2× Reaktionspuffer (Illumina, Nr. 20034197), TDE1 Nextera Tn5 Transposase (Illumina, Nr. 20034197) und nukleasefreies Wasser enthielt. Die Reaktion wurde 30 Minuten lang bei 37 °C in einem Wasserbad inkubiert. Unmittelbar nach der Transposition wurde die DNA mit einem Qiagen MinElute PCR Purification Kit (Qiagen, Nr. 28004) gereinigt. Nach der Reinigung wurde die transponierte DNA mit NEBNext High-Fidelity 2× PCR Master Mix (NEB, #M0541S), den Barcode-Primern AD1_noMX und AD2.1–2.16 und nukleasefreiem Wasser gemischt. Die Proben wurden 12 Zyklen lang amplifiziert. Unmittelbar nach der Amplifikation wurde die DNA mit einem Qiagen MinElute PCR Purification Kit gereinigt. ATAC-seq-Lesevorgänge im FASTQ-Format wurden zunächst einer Qualitätskontrolle unterzogen, um festzustellen, ob Adaptersequenzen oder Segmente mit schlechter Qualität gekürzt werden müssen. Die in diesen Schritten verwendeten Programme waren FastQC v0.11.7, Trim Galore! v0.4.2 und Cutadapt v1.9.1. Die gekürzten Lesevorgänge wurden mit dem Programm HISAT2 v2.0.5 an die Referenzversion des menschlichen Genoms GRCh38/hg38 angepasst. Ausgerichtete Lesevorgänge wurden mit dem Programm sambamba v0.6.8 von doppelten Lesevorgängen befreit. Peaks wurden mit dem Programm MACS v2.1.2 im Broad-Peaks-Modus aufgerufen. Um den Konsenssatz eindeutiger Peaks zu erhalten, werden sogenannte Peaks aus allen Proben mit BEDtools v2.27.0 bei 50 % Überlappung zusammengeführt. Die ursprünglich im BED-Format vorliegenden Konsensus-Peaks wurden in ein Gene Transfer Format (GTF) konvertiert, um mit dem Programm featureCounts v1.6.2 eine schnelle Zählung der Reads unter den Peaks zu ermöglichen. Jedes Feature in der GTF-Datei hat in der zweiten Spalte den Wert „Peak“. Peaks auf den Chromosomen X, Y und mitochondrialer DNA sind von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Rohe Lesezahlen werden in Bezug auf die Bibliotheksgröße normalisiert und mithilfe der Funktion rlog() im R-Paket DESeq2 v1.26.0 in eine Log2-Skalierung umgewandelt.

RNA (> 200 Nukleotide) wurde mit dem Quick-RNA MiniPrep Plus Kit (Zymo Research, #R1057) aus Zellen gereinigt. Die Qualitätskontrollprüfung der RNA-seq-Reads wurde mit FastQC v0.11.7 durchgeführt. Adaptersequenzen und Segmente mit schlechter Qualität wurden mit Trim Galore getrimmt! v0.4.2 und Cutadapt v1.9.1. Die gekürzten Lesevorgänge wurden mit dem Programm STAR v2.6.1e an die Referenzversion des menschlichen Genoms GRCh38/hg38 angepasst. Doppelt ausgerichtete Lesevorgänge wurden mit dem Programm sambamba v0.6.8 entfernt. Die Expression auf Genebene wurde durch Zählen der Merkmale für jedes Gen bewertet, wie in der RefSeq-Datenbank des NCBI definiert. Die Lesezählung erfolgte mit dem Programm featureCounts v1.6.2 aus dem Rsubread-Paket. Rohzahlen wurden in Bezug auf die Bibliotheksgröße normalisiert und mithilfe der Funktion rlog() im R-Paket DESeq2 v1.26.0 in eine Log2-Skala umgewandelt.

CUT&RUN wurde mit dem CUT&RUN Assay Kit (Cell Signaling Technology, #86652) durchgeführt. Kurz gesagt, Zellen oder Tumorgewebe wurden in Einzelzellen dissoziiert und an mit Concanavalin A beschichtete Magnetkügelchen gebunden, mit Digitonin-Puffer permeabilisiert und dann mit primärem Antikörper auf einem Rotator über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die verwendeten Antikörper waren: H3K27ac (Cell Signaling Technology, #8173), H3K27me3 (Cell Signaling Technology, #9733), IgG Control (Cell Signaling Technology, #3900). Die Zellkügelchen-Aufschlämmung wurde zweimal mit Digitonin Wash gewaschen, mit Protein A/G-MNase (pAG-MN) 1 Stunde lang bei 4 °C inkubiert und dann zweimal mit Dig Wash gewaschen. Die Aufschlämmung wurde dann auf einen 4C-Block und MNase gegeben Die Verdauung wurde durch CaCl2 aktiviert. Nach 30 Minuten wurde die Reaktion mit EGTA-STOP-Puffer gestoppt und Fragmente wurden durch 10-minütige Inkubation bei 37 °C freigesetzt. Die DNA wurde aus dem Überstand nach einer 5-minütigen Zentrifugation bei 16.000 g gewonnen und mittels Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Extraktion (Sigma, #145 p3803) und Ethanolfällung im Wesentlichen wie beschrieben gereinigt65,66. Die resultierende DNA wurde unter Verwendung des NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit (New England Biolabs, Nr. E7645) gemäß den Anweisungen des Herstellers zu einer Bibliothek aufgebaut. Die Bibliotheken wurden in einem 100-Basenpaar-Pair-End-Lauf auf dem Next Seq 2000 (Illumina) sequenziert. Die Rohdaten und verarbeiteten Daten werden in der Gene Expression Omnibus-Datenbank (GEO, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) bereitgestellt. Die Lesequalität wurde mit FastQC v0.11.7 bewertet. Adaptersequenzen und Segmente mit schlechter Qualität wurden mit Trim Galore entfernt! v0.4.2 und Cutadapt v1.9.1. Die gekürzten Lesevorgänge wurden mithilfe von Bowtie2 v2.3.4.1 mit den Parametern „--dovetail --local --very-sensitive-local -I 10 -X 700 -p 12 --no-unal -“ an die Referenzversion des menschlichen Genoms hg38 angepasst. -no-discordant --no-mixed". Ausgerichtete Lesevorgänge in IgG-Proben wurden mit dem Programm sambamba v0.6.8 von doppelten Lesevorgängen befreit. Peaks wurden mit MACS v2.1.4 unter Verwendung der Parameter „-g hs -q 0.1“ für H3K27ac-Proben und „--broad -g hs -q 0.1“ für H3K27me3-Proben aufgerufen. BEDtools v2.27.0 wurde verwendet, um Konsensspitzen in zwei Schritten zu erhalten. Im ersten Schritt wurden gemeinsame Peaks zwischen Proben derselben Gruppe ermittelt, indem Peaks ausgewählt wurden, die in mindestens 75 % der Proben derselben Gruppe nachgewiesen wurden. Gemeinsame Peaks in jeder Gruppe aus dem ersten Schritt wurden mit einer Überlappung von 50 % zusammengeführt, um eindeutige Konsenspeaks aus allen Gruppen zu erhalten. Konsenspeaks, ursprünglich im BED-Format, wurden in ein Gene Transfer Format (GTF) konvertiert und für die Lesequantifizierung unter den Peaks mit featureCounts v1.6.2 aus dem Rsubread-Paket verwendet. Peaks auf den Chromosomen X, Y und mitochondrialer DNA sind von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Die Differentialanalyse zwischen Probengruppen wurde mit dem R-Paket DESeq2 v1.26.0 bewertet. Diagramme wurden mit dem Paket ggplot2 und Basisgrafiken in R generiert.

Acht Wochen alte Nod-SICD-Gamma-Null-Mäuse (NSG) wurden unter Isofluran gesetzt. Die Kopfhaut wurde eingeschnitten und 10.000 Zellen/3 μl BT-142-Zellen (shControl, shHDAC1, shHDAC6) in das Striatum injiziert. Mäuse wurden auf die Entwicklung von Tumorsymptomen überwacht. Alle Methoden wurden gemäß einem genehmigten Protokoll des örtlichen IACUC der University of Cincinnati mit relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Alle überlebenden Mäuse wurden nach 21 Wochen getötet. Nach der Tötung wurden die Mäuse einer transkardialen Perfusion unterzogen und die Gehirne wurden entnommen und für 3–7 Tage in 10 %iges Formalin gelegt, bevor sie in eine 30 %ige Saccharoselösung überführt wurden. Anschließend wurden die Gehirne geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind im Garrett Lab Data Directory (https://github.com/TroyCarnwath/garrett_lab) verfügbar. Alle Versuchsprotokolle wurden vom IRB-Komitee der University of Cincinnati genehmigt. Diese Studie verwendete nicht identifizierte Patientenproben und wurde als „Keine Humanforschung“ eingestuft. 19.02.25.02 (05.03.2019). Eine Einwilligung ist nicht anwendbar.

Alle menschlichen Proben werden vom Biorepository der University of Cincinnati bereitgestellt, das dazu dient, anonymisierte Patientenproben des gewünschten Gewebetyps mit klinischen und demografischen Informationen zu versorgen. Dieses Projekt wurde beim IRB der University of Cincinnati eingereicht und erhielt die Bezeichnung „Keine Humanforschung“ (2019-0155). Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

Alle Protokolle zu Xenotransplantationen bei Mäusen, einschließlich der Unterbringung und Verwaltung von Mäusen, wurden vom örtlichen IACUC der University of Cincinnati überprüft und genehmigt (05.04.04.01, herausgegeben am 1.11.2019 und 20.07.16.02, herausgegeben am 28.08.2019). -2020). Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Wir haben die ARRIVE-Richtlinien einschließlich Studiendesign, Stichprobengröße, Einschluss-/Ausschlusskriterien, Randomisierung, Verblindung, Ergebnismaße, statistische Methoden, Versuchstiere, Versuchsverfahren und Ergebnisse überprüft und sind mit diesen Richtlinien im Einklang.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind im Garrett Lab Data Directory (https://github.com/TroyCarnwath/garrett_lab) verfügbar.

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Wir danken dem University of Cincinnati Bioinformatics Core für seine unschätzbare Hilfe bei der experimentellen Gestaltung, Verfeinerung von Hypothesen und Datenanalyse. Wir danken dem Genomics, Epigenomics and Sequencing Core der University of Cincinnati für seine Unterstützung und Anleitung bei der experimentellen Gestaltung und Datenoptimierung. Wir danken Dr. Qi und dem Tumormodellierungsprogramm der University of Cincinnati.

Dr. Garrett wurde durch den B*CURED- und NREF Young Clinician Investigator Award 2021-2022 unterstützt. Dr. Albano wurde durch ein T32 CA236764-04 Training Grant unterstützt. Troy Carnwath wurde durch ein NREF Medical Summer Research Fellowship unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Matthew C. Garrett und Rebecca Albano.

Abteilung für Neurochirurgie, University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, OH, 45267, USA

Matthew C. Garrett, Rebecca Albano und Sanjit Shah

University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, OH, 45267, USA

Troy Carnwath & Merissa Pemberton

Abteilung für Molekulare Zell- und Entwicklungsbiologie, University of California Los Angeles, Los Angeles, CA, 90095, USA

Jungfrau Gott & Harley Kornblum

Abteilung für Krebsbiologie, University of Cincinnati, Cincinnati, OH, 45267, USA

Catherine A. Behrmann & David R. Plas

Abteilung für Neurologie, University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, OH, 45267, USA

Daniel Woo

Abteilung für experimentelle Hämatologie und Krebsbiologie, Abteilung für Pädiatrie, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, OH, USA

Eric O'Brien, Brett VanCauwenbergh, John Perentesis, Chuntao Zhao und Q. Richard Lu

Abteilung für Pathologie und Labormedizin, University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, OH, USA

Matthew Hagan & Ady Kendler

Bioinformatics Collaborative Services, Abteilung für biomedizinische Informatik, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, Cincinnati, OH, USA

Aditi Paranjpe & Krishna Roskin

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Korrespondenz mit Matthew C. Garrett.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Garrett, MC, Albano, R., Carnwath, T. et al. HDAC1 und HDAC6 sind für die Wachstumsförderung bei IDH1-mutierten Gliomen von wesentlicher Bedeutung. Sci Rep 13, 12433 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33889-3

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Eingegangen: 02. Juni 2022

Angenommen: 20. April 2023

Veröffentlicht: 01. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33889-3

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